Esecuzione di quattro test di amplificazione degli acidi nucleici per identificare SARS-CoV-2 in Etiopia

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Dall’epidemia di coronavirus (COVID-19) del 2019, molti test commerciali di amplificazione degli acidi nucleici (NAAT) sono stati sviluppati in tutto il mondo e sono diventati test standard. Sebbene numerosi test siano stati rapidamente sviluppati e applicati ai test diagnostici di laboratorio, le prestazioni di questi test non sono state valutate in una varietà di contesti. Pertanto, questo studio mirava a valutare le prestazioni dei test Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI e Sansure Biotech utilizzando lo standard di riferimento composito (CRS). Lo studio è stato condotto presso l'Ethiopian Public Health Institute (EPHI) dal 1° al 30 dicembre 2020. 164 campioni nasofaringei sono stati estratti utilizzando il mini kit QIAamp RNA e il sistema di preparazione dei campioni Abbott DNA. Su 164 campioni, il 59,1% era positivo e il 40,9% negativo per CRS. La positività a Sansure Biotech era significativamente bassa rispetto alla CRS (p <0,05). La positività a Sansure Biotech era significativamente bassa rispetto alla CRS (p <0,05). I risultati del sondaggio Sansure Biotech non hanno ottenuto risultati soddisfacenti con CRS (p < 0,05). I risultati positivi di Sansure Biotech sono stati significativamente inferiori rispetto a CRS (p < 0,05).Secondo CRS, Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0.05）.Secondo CRS, Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0.05）. Sansure Biotech ha ottenuto un numero medio di risultati positivi rispetto al CRS (p < 0,05). Sansure Biotech ha ottenuto un numero significativamente inferiore di risultati positivi rispetto a CRS (p < 0,05).La concordanza complessiva delle quattro analisi è stata del 96,3-100% rispetto alla CRS. Oltre al basso tasso di positività del test Sansure Biotech, le prestazioni dei quattro test sono state quasi comparabili. Pertanto, il test Sansure Biotech [Research Only (RUO)] richiede un’ulteriore convalida per il suo utilizzo in Etiopia. Infine, dovrebbero essere prese in considerazione ulteriori ricerche per valutare i test con le appropriate affermazioni del produttore.
I test di laboratorio fanno parte del Piano strategico di preparazione e risposta (SPRP) dell’Organizzazione mondiale della sanità (OMS) per la malattia da coronavirus 2019 (COVID-19). L’OMS consiglia ai paesi di sviluppare capacità di laboratorio per migliorare la preparazione, la corretta gestione dei casi, la vigilanza e la risposta rapida alle sfide della salute pubblica. Ciò suggerisce che il ruolo del laboratorio è fondamentale per caratterizzare la malattia e l’epidemiologia degli agenti infettivi emergenti e per controllarne la diffusione.
La diagnosi di COVID-19 richiede informazioni epidemiologiche e mediche, sintomi/segni personali e dati radiografici e di laboratorio2. Da quando è stata segnalata l’epidemia di COVID-19 a Wuhan, in Cina, in tutto il mondo sono stati sviluppati numerosi test commerciali di amplificazione degli acidi nucleici (NAAT). La reazione a catena della polimerasi con trascrizione inversa in tempo reale (rRT-PCR) è stata utilizzata come metodo standard e di routine per la diagnosi di laboratorio dell’infezione da sindrome respiratoria acuta grave 2 (SARS-CoV-2)3. Il rilevamento molecolare di SARS-CoV-2 si basa tipicamente sui geni N (gene della proteina nucleocapside), E (gene della proteina dell’involucro) e RdRp (gene della RNA polimerasi RNA-dipendente) in ORF1a/b (open reading frame 1a/b) . gene) regione identificata dal genoma virale. Sono considerate le principali regioni conservate presenti nei genomi virali per il riconoscimento del virus4. Tra questi geni, i geni RdRp ed E hanno un'elevata sensibilità di rilevamento analitico, mentre il gene N ha una bassa sensibilità analitica5.
Le prestazioni dei test PCR possono variare in base a vari fattori quali: reagenti di estrazione, reagenti di amplificazione/rilevazione, metodo di estrazione, qualità della macchina PCR e altri strumenti. Ad aprile 2020, più di 48 diversi dispositivi diagnostici provenienti da nove paesi hanno ricevuto l'autorizzazione all'uso di emergenza (EUA) per la diagnostica COVID-196. In Etiopia, più di 14 piattaforme PCR in tempo reale vengono utilizzate per il rilevamento PCR di SARS-CoV-2 presso 26 istituzioni sanitarie pubbliche, tra cui ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 e Quant-studio7. Inoltre, sono disponibili vari kit di test PCR, come il test Daan Gene, il test Abbott SARS-CoV-2, il test Sansure Biotech e il test SARS-CoV-2 BGI. Sebbene la rRT-PCR sia altamente sensibile, alcuni pazienti con COVID-19 riportano risultati falsi negativi a causa di copie insufficienti di acido ribonucleico virale (RNA) nei campioni a causa di raccolta, trasporto, conservazione, manipolazione e test di laboratorio impropri. condizioni e azioni del personale8. Inoltre, la cattiva gestione del campione o del controllo, l’impostazione della soglia del ciclo (Ct) e la reattività crociata con altri acidi nucleici patogeni o RNA SARS-CoV-2 inattivo/residuo possono portare a risultati falsi positivi nei test rRT-PCR9. Pertanto, è chiaro che i test PCR possono effettivamente identificare i portatori di frammenti di geni, poiché non possono nemmeno distinguere tra geni virali veramente attivi, quindi i test possono solo identificare i portatori e non i pazienti10. Pertanto, è importante valutare la prestazione diagnostica utilizzando metodi standard nel nostro contesto. Sebbene molti reagenti NAAT siano disponibili presso l’Ethiopian Public Health Institute (EPHI) e in tutto il paese, non è stata ancora riportata alcuna valutazione comparativa della loro efficacia. Pertanto, questo studio mirava a valutare le prestazioni comparative dei kit disponibili in commercio per il rilevamento di SARS-CoV-2 mediante rRT-PCR utilizzando campioni clinici.
In questo studio sono stati inclusi un totale di 164 partecipanti con sospetto COVID-19. La maggior parte dei campioni proveniva da centri di trattamento (118/164 = 72%), mentre i restanti 46 (28%) partecipanti provenivano da centri non di trattamento. Tra i partecipanti non trattati presso il centro, 15 (9,1%) avevano casi clinicamente sospetti e 31 (18,9%) avevano contatti di casi confermati. Novantatré (56,7%) partecipanti erano maschi e l'età media (± SD) dei partecipanti era di 31,10 (± 11,82) anni.
In questo studio sono stati determinati i tassi positivi e negativi di quattro test per COVID-19. Pertanto, i tassi positivi del test Abbott SARS-CoV-2, del test Daan Gene 2019-nCoV, del test SARS-CoV-2 BGI e del test Sansure Biotech 2019-nCoV sono stati rispettivamente del 59,1%, 58,5%, 57,9% e 55,5% . I punteggi positivi e negativi dello standard di riferimento composito (CRS) erano rispettivamente 97 (59,1%) e 67 (40,9%) (Tabella 1). In questo studio, la definizione di CRS era basata sulla regola “qualsiasi positivo”, secondo la quale su quattro risultati del test, due o più risultati del test che davano lo stesso risultato erano considerati veri positivi o negativi.
In questo studio, abbiamo riscontrato una concordanza percentuale negativa (NPA) del 100% (IC 95% 94,6–100) per tutte le analisi rispetto alla CRS. L’analisi Sansure Biotechnology ha mostrato un PPA minimo del 93,8% (IC 95% 87,2-97,1) e l’analisi Daan Gene 2019-nCoV ha avuto una concordanza complessiva del 99,4% (IC 95% 96,6-99,9). Al contrario, la concordanza complessiva tra il test SARS-CoV-2 BGI e il test Sansure Biotech 2019-nCoV è stata rispettivamente del 98,8% e del 96,3% (Tabella 2).
Il coefficiente di concordanza kappa di Cohen tra i risultati del test CRS e Abbott SARS-CoV-2 era pienamente coerente (K = 1,00). Allo stesso modo, anche i valori kappa di Cohen rilevati da Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI e Sansure Biotech 2019-nCoV sono pienamente coerenti con CRS (K ≥ 0,925). In questa analisi comparativa, il test chi-quadrato (test McNemar) ha mostrato che i risultati del test Sansure Biotech 2019-nCoV erano significativamente diversi dai risultati CRS (p = 0,031) (Tabella 2).
Come mostrato nella Fig.1 la percentuale del valore Ct più basso (< 20 Ct) del test Abbott SARS-CoV-2 (gene RdRp e N combinato) era dell'87,6% e il valore Ct del gene ORF1a/b del test Sansure Biotech 2019-nCoV ha mostrato che la percentuale di valori Ct bassi (< 20 Ct) Il valore Ct (< 20 Ct) era del 50,3% e il valore Ct elevato (36-40 Ct) era 3,2%. 1 la percentuale del valore Ct più basso (< 20 Ct) del test Abbott SARS-CoV-2 (gene RdRp e N combinato) era dell'87,6% e il valore Ct del gene ORF1a/b del test Sansure Biotech 2019-nCoV ha mostrato che la percentuale di valori Ct bassi (< 20 Ct) Il valore Ct (< 20 Ct) era del 50,3% e il valore Ct elevato (36-40 Ct) era 3,2%.Come mostrato nella Fig.1, l'analisi basata sul nome Ct (< 20 Ct) di Abbott SARS-CoV-2 (combinazione genetica RdRp e N) è stata sostenuta dall'87,6%, L'analisi dell'analisi del valore Ct dell'ORF1a/b di Sansure Biotech 2019-nCoV ha dimostrato che il professionista ha stabilito un livello elevato del Ct (< 20 Ct) al 50,3%, la concentrazione elevata di Ct (36-40 Ct) è rimasta del 3,2%. 1, la percentuale dell'analisi del valore Ct più basso (< 20 Ct) di Abbott SARS-CoV-2 (gene combinato RdRp e N) era dell'87,6% e il valore Ct dell'analisi del gene ORF1a/b di Sansure Biotech 2019-nCoV ha mostrato che la percentuale di valore Ct basso (< 20 Ct) rappresentava il 50,3% e valore Ct alto (36-40 Ct) rappresentato il 3,2%.如图1 所示, Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比（< 20 Ct）为87.6%, Sansure Biotech 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3%, 高Ct 值(36–40 Ct) percentuale di sconto del 3,2%. Come mostrato nella Figura 1, la percentuale del valore Ct più basso (< 20 Ct) del test Abbott SARS-CoV-2 (combinazione di gene RdRp e N) è dell'87,6%, il valore Ct del gene ORF1a/b del test Sansure Biotech 2019-nCoV mostra un basso Ct值(< 20 Ct) 的 la percentuale è 50,3%, 高Ct La percentuale di 值(36–40 Ct) 的 è del 3,2%. Come riscontrato nel rischio 1, l'analisi di Abbott SARS-CoV-2 (generi RdRp e N) ha avuto un livello di Ct non significativo (< 20 Ct) su un diametro dell'87,6%, un valore Ct generato da ORF1a/b nell'analisi Sansure Biotech 2019- Analisi nCoV ha rilevato un piccolo Ct. Come mostrato nella Figura 1, il test Abbott SARS-CoV-2 (che combina i geni RdRp e N) presentava il valore percentuale Ct più basso (< 20 Ct) pari all'87,6%, mentre il valore Ct del gene ORF1a/b nel test Sansure Studio Biotech 2019 – L’analisi di nCoV ha evidenziato un Ct basso. Il professionista esperto (< 20 Ct) è stato sostenuto dal 50,3%, mentre il professionista esperto (< 20 Ct) è stato sostenuto dal 3,2%. La percentuale dei valori (< 20 Ct) era del 50,3% e la percentuale dei valori Ct elevati (36-40 Ct) era del 3,2%.Il test Abbott SARS-CoV-2 B ha registrato valori Ct superiori a 30. D'altra parte, nel test BGI SARS-CoV-2 il gene ORF1a/b aveva un valore Ct elevato (> 36 Ct), la percentuale era del 4% (Fig. 1). D'altra parte, nel test BGI SARS-CoV-2 il gene ORF1a/b aveva un valore Ct elevato (> 36 Ct), la percentuale era del 4% (Fig. 1). Con un'altra pietra miliare, nell'analisi del gene BGI SARS-CoV-2 ORF1a/b, il valore elevato di Ct (> 36 Ct), il proprietario dell'azienda ha mantenuto il 4% (Ris. 1). D’altra parte, nell’analisi del gene BGI SARS-CoV-2 ORF1a/b presentava un valore Ct elevato (> 36 Ct), la cui percentuale era del 4% (Fig. 1).另一方面,在BGI SARS-CoV-2 检测中,ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比为4%（图1）. D’altra parte, nel rilevamento BGI SARS-CoV-2, la percentuale del gene ORF1a/b con un valore Ct elevato (>36 Ct) è del 4% (Figura 1). In altre circostanze, l'analisi del prototipo BGI SARS-CoV-2 del gene ORF1a/b con i valori Ct (>36 Ct) è stata del 4% (rischio 1). Nell’analisi BGI SARS-CoV-2, invece, la percentuale di geni ORF1a/b con valori Ct elevati (>36 Ct) è stata del 4% (Fig. 1).
In questo studio abbiamo prelevato 164 campioni nasofaringei. Per tutti i tipi di analisi, l'isolamento e l'amplificazione dell'RNA sono stati eseguiti utilizzando i metodi e i kit consigliati dai rispettivi produttori.
Questo studio ha dimostrato che il test di Abbott per SARS-CoV-2 ha le stesse prestazioni di rilevamento del CRS, con una concordanza positiva, negativa e complessiva del 100%. L'accordo kappa di Cohen è 1,00, indicando il pieno accordo con CRS. Uno studio simile condotto dall’Università di Washington negli Stati Uniti ha rilevato che la sensibilità e la specificità complessive del test Abbott per SARS-CoV-2 erano rispettivamente del 93% e del 100%, rispetto al test determinato in laboratorio (LDA) del CDC . 11. Il sistema di rilevamento Abbott SARS-CoV-2 si basa sul rilevamento combinato simultaneo dei geni N e RdRp, poiché entrambi i geni sono più sensibili, riducendo al minimo i falsi negativi12. Uno studio condotto a Vienna, in Austria, ha inoltre dimostrato che grandi volumi di campioni di estrazione e volumi di eluente di rilevamento minimizzavano gli effetti di diluizione e aumentavano l’efficienza di rilevamento13. Pertanto, la perfetta corrispondenza di Abbott per il test SARS-CoV-2 può essere associata a un sistema di rilevamento della piattaforma che rileva simultaneamente i geni combinatori, estrae un gran numero di campioni (0,5 ml) e utilizza una grande quantità di eluente (40 µl).
I nostri risultati hanno anche mostrato che le prestazioni di rilevamento del test genetico Daan erano quasi le stesse di quelle del CRS. Ciò è coerente con uno studio14 condotto presso l'Università Anhui di Huainan, in Cina, e con l'affermazione del produttore di un accordo positivo al 100%. Nonostante le segnalazioni di risultati coerenti, un campione è risultato falso negativo dopo aver analizzato nuovamente lo stesso eluato, ma è risultato positivo nei test Abbott SARS-CoV-2 e Sansure Biotech nCoV-2019. Ciò suggerisce che potrebbe esserci variabilità nei risultati tra diversi tipi di analisi. Tuttavia, nello studio condotto in Cina15, il risultato del test del gene Daan era significativamente diverso (p < 0,05) rispetto al test di riferimento definito dal laboratorio. Tuttavia, nello studio condotto in Cina15, il risultato del test del gene Daan era significativamente diverso (p < 0,05) rispetto al test di riferimento definito dal laboratorio. Ciò non significa, nell'analisi provata in Cina15, il risultato dell'analisi di Daan Gene è stato escluso (p < 0,05) da è un'analisi di laboratorio completa. Tuttavia, in uno studio condotto in Cina15, il risultato dell'analisi di Daan Gene era significativamente diverso (p < 0,05) dall'analisi di riferimento del laboratorio.然而,在中国进行的研究中15,大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p < 0,05）。Vedi l'originale 15与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Однако в исследовании, provеденном в China15, результаты генетического теста Daan значительно отличались (p < 0,05) in base al testo di laboratorio italiano. Tuttavia, in uno studio condotto in Cina15, i risultati del test genetico di Daan erano significativamente diversi (p < 0,05) rispetto al test del laboratorio di riferimento.Questa discrepanza potrebbe essere dovuta alla sensibilità del test di riferimento nel rilevare SARS-CoV-2 e ulteriori studi potrebbero essere importanti per determinarne la causa.
Inoltre, il nostro studio ha valutato le prestazioni comparative del test SARS-CoV-2 BGI con CRS, mostrando un eccellente accordo percentuale positivo (PPA = 97,9%), accordo percentuale negativo (NPA = 100%) e accordo percentuale complessivo per genere ( OPA). ). = 98,8%). I valori Kappa di Cohen hanno mostrato un buon accordo (K = 0,975). Gli studi condotti nei Paesi Bassi16 e in Cina15 hanno mostrato risultati coerenti. Il test SARS-CoV-2 BGI è un test di rilevamento di un singolo gene (ORF1a/b) che utilizza 10 µl di eluato di amplificazione/rilevamento. Nonostante il buon accordo statistico con i nostri risultati di riferimento, l’analisi ha mancato due campioni positivi (1,22%) del campione totale. Ciò può avere enormi implicazioni cliniche per le dinamiche di trasmissione sia a livello del paziente che della comunità.
Un’altra analisi comparativa inclusa in questo studio è stata il test Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO); la percentuale di corrispondenza complessiva è stata del 96,3%. La forza dell'accordo è stata determinata anche dal valore Kappa di Cohen, che era 0,925, indicando il pieno accordo con il CRS. Ancora una volta, i nostri risultati sono identici agli studi condotti presso la Central South University di Changsha, in Cina, e presso il Dipartimento di laboratorio clinico dell'Ospedale popolare di Liuzhou, città di Liuzhou, Cina17. Nonostante sia stata registrata la buona concordanza statistica di cui sopra, il test chi-quadrato (test MacNemar) ha mostrato che il risultato del test Sansure Biotech ha avuto una differenza statisticamente significativa rispetto al CRS (p < 0,005). Nonostante sia stata registrata la buona concordanza statistica di cui sopra, il test chi-quadrato (test MacNemar) ha mostrato che il risultato del test Sansure Biotech ha avuto una differenza statisticamente significativa rispetto al CRS (p < 0,005). Non so cosa è successo con la tua migliore statistica statistica, i criteri di classificazione (criterio Maknemara) ha indicato il risultato dell'analisi di Sansure Biotech che contiene statistiche statistiche basate su CRS (p < 0,005). Nonostante sia stato registrato il buon accordo statistico di cui sopra, il test chi-quadrato (test McNemar) ha mostrato che il risultato del test Sansure Biotech presentava una differenza statisticamente significativa rispetto al CRS (p < 0,005).Per saperne di più, vedere l'articolo su MacNemar, Sansure Biotech 检测的结果与CRS相比具有统计学显着差异（p < 0.005）.尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性, 但 检验 （（（macnemar 检验 表明, sansure biotech 检测 结果 与 crs相比 具有 显着 （（p <0.005。。。。。。。。。。。。。。。。。。）））） Il problema della tua migliore statistica statistica è stato visualizzato sui criteri di classificazione (criteri di Maknemara) statistica statistica (p < 0,005) tramite l'analisi di Sansure Biotech e CRS. Nonostante il buon accordo statistico sopra menzionato, il test chi-quadrato (test McNemar) ha mostrato una differenza statisticamente significativa (p < 0,005) tra il test Sansure Biotech e il CRS.Sei campioni (3,66%) sono risultati falsi negativi rispetto al CRS (Tabella supplementare 1); questo è molto importante, soprattutto vista la dinamica di trasmissione del virus. Anche i dati di cui sopra supportano questo basso tasso di rilevamento15.
In questo studio, i valori Ct sono stati determinati per ciascun test e rispettiva piattaforma, con il valore Ct medio più basso riportato nel test Abbott SARS-CoV-2. Questo risultato potrebbe essere correlato al sistema di test genetici combinati simultanei di Abbott per il rilevamento di SARS-CoV-2. Pertanto, secondo la Figura 1, l’87,6% dei risultati Abbott SARS-CoV-2 presentava valori Ct inferiori a 20. Solo un piccolo numero di risultati dei campioni (12,4%) rientrava nell’intervallo 20-30. Non sono stati registrati valori Ct superiori a 30. Oltre all'utilizzo da parte di Abbott del formato di test genetico del pannello SARS-CoV-2, questo risultato potrebbe essere correlato al limite di rilevamento inferiore (32,5 copie di RNA/mL)18, che è tre volte inferiore al limite inferiore dell'azienda di 100 copie di RNA /ml. ml)19.
Questo studio presenta alcune limitazioni: in primo luogo, non disponiamo di metodi standard/di riferimento [come la carica virale o altri test di laboratorio (LDA)] a causa della mancanza di risorse. In secondo luogo, tutti i campioni utilizzati in questo studio erano tamponi nasofaringei, mentre i risultati non erano applicabili ad altri tipi di campioni e, in terzo luogo, la dimensione del campione era ridotta.
Questo studio ha confrontato le prestazioni di quattro test rRT-PCR per SARS-CoV-2 utilizzando campioni nasofaringei. Tutti i test di rilevamento hanno avuto prestazioni quasi comparabili, ad eccezione del test Sansure Biotech. Inoltre, il basso tasso di positività è stato identificato nel test Sansure Biotech rispetto al CRS (p < 0,05). Inoltre, il basso tasso di positività è stato identificato nel test Sansure Biotech rispetto al CRS (p < 0,05). Inoltre, il test Sansure Biotech ha ottenuto i risultati del test CRS (p < 0,05). Inoltre, il test Sansure Biotech ha mostrato una bassa percentuale di risultati positivi rispetto al CRS (p < 0,05).Secondo CRS, Sansure Biotech ha ottenuto risultati positivi (p < 0,05).Secondo CRS, Sansure Biotech ha ottenuto risultati positivi (p < 0,05). Inoltre, l'analisi di Sansure Biotech ha evidenziato i risultati più positivi ottenuti con CRS (p < 0,05). Inoltre, il test Sansure Biotech ha avuto un tasso di positività inferiore rispetto al CRS (p < 0,05).L’analisi Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) di PPA, NPA e concordanza complessiva ha superato il 93,5% con un valore di forza della concordanza Cohen Kappa pari a 0,925. Infine, il Sansure Biotech Assay (RUO) necessita di ulteriore convalida per l’uso in Etiopia e si dovrebbero prendere in considerazione ulteriori ricerche per valutare le affermazioni dei singoli produttori.
Il disegno dello studio comparativo è stato condotto presso quattro strutture sanitarie ad Addis Abeba, l'ospedale Eka Kotebe, il Millennium Church Treatment Center, lo Zewooditu Memorial Hospital e l'ospedale specialistico per la tubercolosi di San Pietro. I dati sono stati raccolti tra il 1° e il 31 dicembre 2020. Le strutture mediche per questo studio sono state scelte appositamente in base all'elevato numero di casi e alla disponibilità dei principali centri di trattamento della città. Allo stesso modo, gli strumenti, inclusi gli strumenti per PCR in tempo reale ABI 7500 e Abbott m2000, sono stati selezionati in base alle raccomandazioni dei produttori di reagenti NAAT e per questo studio sono stati selezionati quattro kit di rilevamento PCR, poiché la maggior parte dei laboratori in Etiopia utilizzavano almeno quattro di loro. test genetico, test Abbott SARS-CoV-2, test Sansure Biotech e test SARS-CoV-2 BGI eseguiti durante lo studio).
Il test per SARS-CoV-2 è stato eseguito dal 1° al 30 dicembre 2020 utilizzando 3 ml di Viral Transport Medium (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, Cina) da individui sotto indagine per COVID-19 riferiti a EPHI. I campioni nasofaringei sono stati raccolti da raccoglitori di campioni addestrati e inviati all'EPHI in confezioni triple. Prima dell'isolamento dell'acido nucleico, a ciascun campione viene assegnato un numero di identificazione univoco. L'estrazione viene eseguita da ciascun campione immediatamente all'arrivo utilizzando metodi di estrazione manuali e automatici. Pertanto, per l'estrazione automatica di Abbott m2000, 1,3 ml (inclusi 0,8 ml di volume morto e 0,5 ml di volume dell'ingresso di estrazione) del campione sono stati estratti da ciascun campione e fatti passare attraverso l'Abbott DNA Sample Presentation System (Abbott Molecular Inc. des Plaines, Illinois, Stati Uniti). ) Un lotto di 96 [92 campioni, due controlli di rilevamento e due controlli non modello (NTC)] è stato incluso nel processo complessivo (recupero e rilevamento) di due cicli di SARS-CoV-2 (EUA) in tempo reale. minerario. Allo stesso modo, per l'estrazione manuale, utilizzare gli stessi campioni (per l'estrazione e il rilevamento automatici). Pertanto, durante tutto il processo, 140 µl di campioni sono stati suddivisi in aliquotazioni ed estratti utilizzando il kit QIAamp Viral RNA Mini (QIAGEN GmbH, Hilden, Germania) in lotti da 24 (inclusi 20 campioni, due controlli del test e due NTC) nel corso di nove cicli. Gli eluati estratti manualmente sono stati amplificati e rilevati utilizzando un termociclatore ABI 7500 utilizzando il test SARS-CoV-2 BGI, il test Daan Gene e il test Sansure Biotech.
L'isolamento e la purificazione automatizzati dell'RNA virale SARS-CoV-2 seguono il principio delle microsfere magnetiche utilizzando i reagenti Abbott per la preparazione dei campioni di DNA. L'inattivazione dei campioni e la solubilizzazione delle particelle virali viene effettuata utilizzando un detergente contenente isotiocianato di guanidina per denaturare la proteina e inattivare l'RNasi. L'RNA viene poi separato dalla proteina mediante separazione in fase solida utilizzando silice, ovvero il sale di guanidinio e il pH alcalino del tampone di lisi favoriscono il legame degli acidi nucleici con la silice (SiO2). La fase di risciacquo rimuove le proteine ​​rimanenti e i detriti per produrre una soluzione limpida. L'RNA trasparente viene isolato da microparticelle a base di silice utilizzando il campo magnetico dello strumento20,21. D'altra parte, l'isolamento e la purificazione manuale dell'RNA vengono effettuati con il metodo della colonna centrifugante utilizzando la centrifugazione invece di un supporto magnetico e la separazione delle microparticelle dall'eluente.
Il test di rilevamento Abbott Real-Time SARS-CoV-2 (Abbott Molecular, Inc.) è stato eseguito secondo le istruzioni del produttore, che ha ricevuto EUA19,22 dall'OMS e dalla FDA. In questo protocollo, l'inattivazione del campione prima dell'estrazione è stata eseguita a bagnomaria a 56°C per 30 minuti. Dopo l'inattivazione del virus, l'estrazione dell'acido nucleico è stata eseguita su uno strumento Abbott m2000 SP da 0,5 ml di VTM utilizzando un sistema di preparazione dei campioni di DNA Abbott m2000. secondo il produttore. L'amplificazione e il rilevamento sono stati eseguiti utilizzando uno strumento RT-PCR Abbott m2000 ed è stato eseguito un doppio rilevamento per i geni RdRp e N. ROX) e VIC P (colorante proprietario) per il targeting e il rilevamento dei controlli interni, consentendo il rilevamento simultaneo di entrambi i prodotti di amplificazione 19 .
Il metodo di rilevamento dell'amplificazione di questo kit si basa sulla tecnologia RT-PCR in un unico passaggio. I geni ORF1a/be N sono stati selezionati come regioni conservate dalla Daan Gene Technology per rilevare l'amplificazione della regione target. Primer specifici e sonde fluorescenti (sonde del gene N marcate con FAM, sonde ORF1a/b marcate con VIC) sono stati progettati per rilevare l’RNA del SARS-CoV-2 nei campioni. L'eluente finale e le miscele master sono state preparate aggiungendo 5 µl di eluente a 20 µl della miscela master fino ad un volume finale di 25 µl. L'amplificazione e il rilevamento sono stati eseguiti simultaneamente su uno strumento PCR in tempo reale ABI 750024.
I geni ORF1a/b e N sono stati rilevati utilizzando il kit diagnostico dell’acido nucleico nCoV-2019 Sansure Biotech (rilevamento PCR fluorescente). Preparare sonde specifiche per ciascun gene bersaglio selezionando il canale FAM per la regione ORF1a/be il canale ROX per il gene N. A questo kit di analisi, l'eluente e i reagenti della miscela master vengono aggiunti come segue: preparare 30 µl di reagente della miscela master e 20 µl di campione eluito per il rilevamento/amplificazione. Per l'amplificazione/rilevamento è stato utilizzato il real-time PCR ABI 750025.
Il test SARS-CoV-2 BGI è un kit rRT-PCR in tempo reale fluorescente per la diagnosi di COVID-19. La regione bersaglio si trova nella regione ORF1a/b del genoma SARS-CoV-2, che è un metodo di rilevamento di un singolo gene. Inoltre, il gene domestico umano β-actina è un gene bersaglio regolato internamente. La master mix viene preparata mescolando 20 µl del reagente della master mix e 10 µl del campione di RNA estratto in una piastra a pozzetti26. Per l'amplificazione e il rilevamento è stato utilizzato uno strumento PCR quantitativo in tempo reale fluorescente ABI 7500. Tutta l'amplificazione degli acidi nucleici, le condizioni di esecuzione della PCR per ciascun test e l'interpretazione dei risultati sono state eseguite secondo le istruzioni del rispettivo produttore (Tabella 3).
In questa analisi comparativa, non abbiamo utilizzato il metodo dello standard di riferimento per determinare la concordanza percentuale (positiva, negativa e complessiva) e altri parametri di confronto per le quattro analisi. Ogni confronto tra test è stato effettuato con CRS, in questo studio il CRS è stato impostato in base alla regola "qualsiasi positivo" e il risultato è stato determinato, non da un singolo test, abbiamo utilizzato almeno due risultati di test corrispondenti. Inoltre, nel caso della trasmissione del COVID-19, i risultati falsi negativi sono più pericolosi dei risultati falsi positivi. Pertanto, per dire “positivo” nel modo più accurato possibile da un risultato CRS, almeno due test devono essere positivi, il che significa che è probabile che almeno un risultato positivo provenga da un test EUA. Pertanto, su quattro risultati del test, due o più risultati del test che danno lo stesso risultato sono considerati veri positivi o negativi18,27.
I dati sono stati raccolti utilizzando moduli strutturati di estrazione dei dati, l'immissione e l'analisi dei dati sono stati eseguiti utilizzando il software statistico Excel e SPSS versione 23.0 per le statistiche descrittive. Sono stati analizzati la concordanza percentuale positiva, negativa e complessiva ed è stato utilizzato un punteggio Kappa per determinare il grado di concordanza di ciascun metodo con CRS. I valori Kappa sono interpretati come segue: da 0,01 a 0,20 per accordo lieve, da 0,21 a 0,40 per accordo generale, da 0,41 a 0,60 per accordo moderato, da 0,61 a 0,80 per accordo maggiore e da 0,81 a 0,99 per accordo completo28.
L'autorizzazione etica è stata ottenuta dall'Università di Addis Abeba e tutti i protocolli sperimentali per questo studio sono stati approvati dal comitato di revisione etica scientifica dell'Istituto di sanità pubblica etiope. Il numero di riferimento per la Licenza Etica EPHI è EPHI/IRB-279-2020. Tutti i metodi sono stati applicati in conformità con le raccomandazioni e le disposizioni delle Linee guida complete nazionali etiopi per il trattamento di COVID-19. Inoltre, prima della partecipazione allo studio è stato ottenuto il consenso informato scritto da tutti i partecipanti allo studio.
Tutti i dati ottenuti o analizzati in questo studio sono inclusi in questo articolo pubblicato. I dati a supporto dei risultati di questo studio sono disponibili presso il rispettivo autore su ragionevole richiesta.
Organizzazione mondiale della sanità. Raccomandazioni per le strategie di test di laboratorio per COVID-19: Guida provvisoria, 21 marzo 2020 n. WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (OMS, 2020).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI Diagnosi intelligente COVID-19 al pronto soccorso: tutto in pratica. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI Diagnosi intelligente COVID-19 al pronto soccorso: tutto in pratica.Muliou, DS, Pantazopoulos, I. e Gurgulianis, KI Diagnosi intelligente di COVID-19 nel pronto soccorso: tutto in pratica.Muliou DS, Pantazopoulos I. e Gurgulyanis KI Diagnosi intelligente di COVID-19 nei dipartimenti di emergenza: integrazione end-to-end nella pratica. Esperto Reverendo Respire. medicinale. 3, 263–272 (2022).
Mitchell, SL e St George, K. Valutazione del test COVID19 ID NOW EUA. Mitchell, SL e St George, K. Valutazione del test COVID19 ID NOW EUA.Mitchell, SL e St. George, K. Valutazione del test COVID19 ID NOW EUA.Mitchell SL e St. George K. Valutazione del test COVID19 ID NOW EUA. J. Clinico. Virus. 128, 104429. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
CHI. Rilevazione di laboratorio della malattia da coronavirus 2019 (COVID-19) in sospetta malattia umana. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (visitato il 15 agosto 2020) (OMS, 2020).
Udugama, B. et al. Diagnosi COVID-19: malattie e strumenti di test. ACS Nano 14(4), 3822–3835 (2020).
Syed S. et al. Istituzione del Collegio dei Patologi dell’Africa Orientale, Centrale e Meridionale – Scuola Regionale di Patologia del Medio Oriente e del Sud Africa. Africa. J. Lab. medicinale. 9(1), 1-8 (2020).
Istituto etiope di sanità pubblica, Ministero federale della sanità. Strategia nazionale provvisoria e guida per la diagnosi di laboratorio di COVID-19. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/EPHI_PHEOC_COVID-19_Laboratory_Diagnosis_Eng.pdf (visitato il 12 agosto 2020) (EPHI, 2020).
Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Test falsi negativi per le sfide e le implicazioni dell'infezione da SARS-CoV-2. Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Test falsi negativi per le sfide e le implicazioni dell'infezione da SARS-CoV-2.Voloshin S., Patel N. e Kesselheim AS Test falsi negativi per le infezioni da SARS-CoV-2 e le loro conseguenze.Voloshin S., Patel N. e Kesselheim AS Test falsi negativi per la provocazione e l'impatto dell'infezione da SARS-CoV-2. N. ing. J. Medicina. 383(6), e38 (2020).
Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Casi di COVID-19 falsi positivi e falsi negativi: strategie di prevenzione e gestione respiratoria, vaccinazione e ulteriori prospettive. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Casi di COVID-19 falsi positivi e falsi negativi: strategie di prevenzione e gestione respiratoria, vaccinazione e ulteriori prospettive. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Protezione sanitaria e sanitaria per il COVID-19: terapia respiratoria e strategie lesioni, vaccinazioni e prospettive dispersive. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Casi falsi positivi e falsi negativi di COVID-19: strategie di prevenzione e trattamento respiratorio, vaccinazione e via da seguire.Muliu, DS e Gurgulianis, KI Casi falsi positivi e falsi negativi di COVID-19: strategie per la prevenzione e il trattamento respiratorio, vaccinazione e via da seguire. Esperto Reverendo Respire. medicinale. 15(8), 993–1002 (2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. Diagnosi COVID-19 al pronto soccorso: vedere l'albero ma perdere la foresta. Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. Diagnosi COVID-19 al pronto soccorso: vedere l'albero ma perdere la foresta.Mouliou, DS, Ioannis, P. e Konstantinos, G. Diagnosi COVID-19 al pronto soccorso: vedere l'albero, perdere la foresta.Muliou DS, Ioannis P. e Konstantinos G. Diagnosi COVID-19 nei pronto soccorso: foresta insufficiente per gli alberi. Apparire. medicinale. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. et al. Validazione e convalida delle prestazioni analitiche e cliniche del test Abbott RealTime SARS-CoV-2. J. Clinico. Virus. 129, 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Confronto di cinque set di primer provenienti da diverse regioni del genoma di COVID-19 per il rilevamento dell'infezione virale mediante RT-PCR convenzionale. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Confronto di cinque set di primer provenienti da diverse regioni del genoma di COVID-19 per il rilevamento dell'infezione virale mediante RT-PCR convenzionale.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. e Aflatunyan, B. Confronto di cinque set di primer provenienti da diverse regioni del genoma COVID-19 per il rilevamento dell'infezione virale mediante RT-PCR convenzionale. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. 比较来自COVID-19不同基因组区域的五个引物组,用于通过常规RT-PCR 检测病毒感染. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Confronto di 5 diverse regioni genetiche di COVID-19 per il rilevamento dell'infezione virale mediante RT-PCR convenzionale.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neyestanaki D, Fazlalipour M. e Aflatunyan B. Confronto di cinque set di primer provenienti da diverse regioni del genoma COVID-19 per il rilevamento dell'infezione virale mediante RT-PCR convenzionale.Iran. J. Microbiologia. 12(3), 185 (2020).
Goertzer, I. et al. Risultati preliminari del programma nazionale di valutazione esterna della qualità per il rilevamento delle sequenze del genoma SARS-CoV-2. J. Clinico. Virus. 129, 104537. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. et al. Valutazione analitica dell'efficacia di cinque kit RT-PCR per la sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2. J. Clinico. laboratorio. ano. 35(1), e23643 (2021).
Wang B. et al. Valutazione di sette kit di rilevamento dell’RNA SARS-CoV-2 disponibili in commercio in Cina basati sulla reazione a catena della polimerasi (PCR) in tempo reale. clinico. Chimico. laboratorio. medicinale. 58(9), e149–e153 (2020).
van Casteren, PB et al. Confronto di sette kit diagnostici commerciali RT-PCR COVID-19. J. Clinico. Virus. 128, 104412 (2020).
Lu, Yu et al. Confronto delle prestazioni diagnostiche di due kit PCR per la rilevazione degli acidi nucleici SARS-CoV-2. J. Clinico. laboratorio. ano. 34(10), e23554 (2020).
Lefart, PR, ecc. Uno studio comparativo di quattro piattaforme di test di amplificazione dell'acido nucleico (NAAT) SARS-CoV-2 ha mostrato che le prestazioni di ID NOW erano significativamente peggiorate a seconda del paziente e del tipo di campione. diagnosi. microbiologia. Infettare. diss. 99(1), 115200 (2021).
Molecola di Abbott. Foglietto illustrativo dell'analisi SARS-CoV-2 in tempo reale Abbott. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/RealTime-SARS-CoV-2-Assay. 1-12. (Al 10 agosto 2020) (2020).
Klein, S. et al. Isolamento dell'RNA SARS-CoV-2 mediante biglie magnetiche per il rilevamento rapido su larga scala mediante RT-qPCR e RT-LAMP. Virus 12(8), 863 (2020).