Prestazioni di quattro saggi di amplificazione dell'acido nucleico per identificare SARS-CoV-2 in Etiopia

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Dall'epidemia di coronavirus (Covid-19) del 2019, molti test di amplificazione dell'acido nucleico commerciale (NAAT) sono stati sviluppati in tutto il mondo e sono diventati test standard. Sebbene diversi test siano stati rapidamente sviluppati e applicati ai test diagnostici di laboratorio, le prestazioni di questi test non sono state valutate in una varietà di impostazioni. Pertanto, questo studio mirava a valutare le prestazioni del gene Abbott SARS-CoV-2, DAAN, BGI e sanscrizione di biotecnologie utilizzando lo standard di riferimento composito (CRS). Lo studio è stato condotto presso l'Etiopian Public Health Institute (EPHI) dal 1 al 30 dicembre 2020. 164 campioni di nasofaringeo sono stati estratti utilizzando il mini kit Qiaamp RNA e il sistema di preparazione del campione del DNA Abbott. Dei 164 esemplari, il 59,1% era positivo e il 40,9% era negativo per il CRS. La positività della biotecnologica sanrizzata era significativamente bassa rispetto al CRS (P <0,05). La positività della biotecnologica sanrizzata era significativamente bassa rispetto al CRS (P <0,05). Положитеstituire I risultati positivi di Sansure Biotech erano significativamente più bassi rispetto al CRS (P <0,05).与 CRS 相比 ， Biotecnologio sanscritto 的阳性率显着较低 （P <0,05 ）。与 CRS 相比 ， Biotecnologio sanscritto 的阳性率显着较低 （P <0,05 ）。 У sansura biotech ыло значительно менше положительных рзльтатов по ср рввнению с CRS (p <0,05). La biotecnologia sanxure ha avuto risultati positivi significativamente meno rispetto al CRS (P <0,05).L'accordo complessivo delle quattro analisi era del 96,3-100% rispetto al CRS. Oltre al basso tasso di positività del test biotecnologio sanscritto, le prestazioni dei quattro test erano quasi comparabili. In quanto tale, il test biotecnole di sanscrizione [solo ricerca (Ruo)] richiede una convalida aggiuntiva per il suo utilizzo in Etiopia. Infine, dovrebbero essere considerate ulteriori ricerche per valutare i test con le richieste del produttore appropriate.
I test di laboratorio fanno parte del piano strategico dell'Organizzazione mondiale della sanità (OMS) per la malattia e la risposta della malattia del coronavirus 2019 (COVID-19) (SPRP). L'OMS consiglia che i paesi debbano sviluppare la capacità di laboratorio per migliorare la preparazione, la corretta gestione dei casi, la vigilanza e la rapida risposta alle sfide per la salute pubblica. Ciò suggerisce che il ruolo del laboratorio è la chiave per caratterizzare la malattia e l'epidemiologia degli agenti infettivi emergenti e il controllo della loro diffusione.
La diagnosi di Covid-19 richiede informazioni epidemiologiche e mediche, sintomi/segni personali e dati radiografici e di laboratorio2. Da quando è stato riportato l'epidemia di Covid-19 a Wuhan, in Cina, molti test di amplificazione dell'acido nucleico commerciale (NAAT) sono stati sviluppati in tutto il mondo. La reazione a catena della polimerasi inversa inversa in tempo reale (RRT-PCR) è stata utilizzata come metodo di routine e standard per la diagnosi di laboratorio della sindrome respiratoria acuta grave 2 (SARS-CoV-2) 3 infezione. La rilevazione molecolare di SARS-CoV-2 si basa in genere sui geni N (Gene di proteina nucleocapsid), E (gene proteico dell'involucro) e RDRP (gene RNA-polimerasi RNA-dipendente dell'RNA) in ORF1A/B (cornice di lettura aperta 1A/B). gene) regione identificata dal genoma virale. Sono considerate le principali regioni conservate presenti nei genomi virali per il riconoscimento del virus4. Tra questi geni, i geni RDRP ed E hanno un'elevata sensibilità di rilevamento analitico, mentre il gene N ha una bassa sensibilità analitica5.
Le prestazioni dei test PCR possono variare a seconda di vari fattori quali: reagenti di estrazione, reagenti di amplificazione/rilevamento, metodo di estrazione, qualità della macchina PCR e altri strumenti. Ad aprile 2020, oltre 48 diversi dispositivi diagnostici provenienti da nove paesi hanno ricevuto l'autorizzazione di uso di emergenza (EUA) per la diagnostica Covid-196. In Etiopia, più di 14 piattaforme PCR in tempo reale vengono utilizzate per il rilevamento di PCR di SARS-CoV-2 in 26 istituzioni di sanità pubblica, tra cui ABI 7500, Abbott M2000, Roche 48000 e Quant-Studio7. Inoltre, sono disponibili vari kit di test PCR, come il test del gene DAAN, il test Abbott SARS-CoV-2, il test di biotecnologie sanxure e il test BGI SARS-CoV-2. Sebbene RRT-PCR sia altamente sensibile, alcuni pazienti con covid-19 riportano falsi risultati a causa di copie insufficienti di acido ribonucleico virale (RNA) nei campioni a causa di raccolta impropria, trasporto, conservazione e maneggevolezza e test di laboratorio. Condizioni e azioni del personale8. Inoltre, la cattiva gestione del campione o il controllo, la soglia del ciclo (CT) e la reattività crociata con altri acidi nucleici patogeni o RNA SARS-CoV-2 inattivi/residui possono portare a risultati falsi positivi nei test RRT-PCR9. Pertanto, è chiaro che i test della PCR possono effettivamente identificare i portatori di frammenti genici, in quanto non possono nemmeno distinguere tra geni virali veramente attivi, quindi i test possono solo identificare i portatori e non i pazienti10. Pertanto, è importante valutare le prestazioni diagnostiche utilizzando metodi standard nella nostra impostazione. Sebbene molti reagenti NAAT siano disponibili presso il Etiopian Public Health Institute (EPHI) e in tutto il paese, non è stata ancora segnalata alcuna valutazione comparativa della loro efficacia. Pertanto, questo studio mirava a valutare le prestazioni comparative dei kit disponibili in commercio per il rilevamento di SARS-CoV-2 mediante RRT-PCR usando campioni clinici.
In questo studio sono stati inclusi un totale di 164 partecipanti con sospetti Covid-19. La maggior parte dei campioni proveniva da centri di trattamento (118/164 = 72%), mentre i restanti 46 (28%) partecipanti provenivano da centri di non trattamento. Tra i partecipanti non trattati al centro, 15 (9,1%) avevano casi clinicamente sospetti e 31 (18,9%) avevano contatti di casi confermati. Novantatre (56,7%) partecipanti erano maschi e l'età media (± DS) dei partecipanti era di 31,10 (± 11,82) anni.
In questo studio sono stati determinati tassi positivi e negativi di quattro test per Covid-19. Pertanto, i tassi positivi del test Abbott SARS-CoV-2, del test DAAN Gene 2019-NCOV, del test BGI SARS-CoV-2 e della sanzione biotecnologica 2019-NCOV erano rispettivamente del 59,1%, 58,5%, 57,9% e 55,5%. I punteggi di riferimento composito positivo e negativo (CRS) erano rispettivamente 97 (59,1%) e 67 (40,9%) (Tabella 1). In questo studio, la definizione di CRS si basava sulla regola "positiva", per cui su quattro risultati dei test, due o più risultati dei test che hanno dato lo stesso risultato sono stati considerati veri positivi o negativi.
In questo studio, abbiamo riscontrato un accordo percentuale negativo (NPA) del 100% (IC 95% 94,6-100) per tutte le analisi rispetto al CRS. L'analisi biotecnologica sanscrita ha mostrato un PPA minimo del 93,8% (IC 95% 87.2-97.1) e l'analisi DAAN Gene 2019-NCOV avevano un accordo complessivo del 99,4% (IC 95% 96.6-99,9). Al contrario, l'accordo complessivo tra il dosaggio BGI SARS-CoV-2 e il test di Sansure Biotech 2019-NCOV era rispettivamente del 98,8% e del 96,3% (Tabella 2).
Il coefficiente di accordo Kappa di Cohen tra CRS e Abbott SARS-CoV-2 Risultati è stato completamente coerente (K = 1,00). Allo stesso modo, i valori Kappa di Cohen rilevati da Daan Gene 2019-NCOV, SARS-CoV-2 BGI e sansure Biotech 2019-NCOV sono anche completamente coerenti con CRS (K ≥ 0,925). In questa analisi comparativa, il test Chi-quadrato (test McNemar) ha mostrato che i risultati del dosaggio di Sansure Biotech 2019-NCOV erano significativamente diversi dai risultati CRS (p = 0,031) (Tabella 2).
Come mostrato in Fig.1 La percentuale del valore CT più basso (<20 CT) del dosaggio Abbott SARS-CoV-2 (gene combinato RDRP e N) era dell'87,6% e il valore CT del gene ORF1A/B del valore di Sansure Biotech 2019-NCOV ha mostrato che la percentuale di percentuale a basso valore CT (<20 CT) era del 50,3% e l'alto valore CT (36-40 CT) era 3,2%. 1 La percentuale del valore CT più basso (<20 CT) del dosaggio Abbott SARS-CoV-2 (gene combinato RDRP e N) era dell'87,6% e il valore CT del gene ORF1A/B del valore di Sansure Biotech 2019-NCOV ha mostrato che la percentuale di percentuale a basso valore CT (<20 CT) era del 50,3% e l'alto valore CT (36-40 CT) era 3,2%.Come mostrato in Fig.1. ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого значения Ct (< 20 Ct) составлял 50,3%, а высокое значение Ct (36–40 Ct) составлopea 3,2%. 1, la percentuale dell'analisi CT più bassa (<20 CT) di Abbott SARS-COV-2 (gene combinato RDRP e N) era dell'87,6%e il valore CT dell'analisi del gene ORF1A/B di Sansure Biotech 2019-NCOV ha mostrato che la percentuale a basso valore CT (<20 CT) rappresentava il 50,3%e il valore di alto valore (36-40 ct) di 36-40 ct) che ha mostrato il 36%di sanscrizione (36-40 ct).如图 1 所示 ， Abbott SARS-COV-2 检测 （结合 RDRP 和 N 基因）的最低 CT 值百分比 （<20 ct ）为 87,6%， Biotecnologio sanscritto 2019-NCOV 检测的 ORF1A/B 基因 CT 值显示低 CT 值 (<20 ct) 的百分比为 50,3%， 高 CT 值 (36-40 CT) Come mostrato nella Figura 1, la percentuale di valore CT più bassa (<20 CT) del test Abbott SARS-COV-2 (combinazione di RDRP e N gene) è dell'87,6%, il valore CT del gene ORF1A/B di Sansure Biotech 2019-NCOV mostra una bassa CT 值 (<20 ct) 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的3,2%. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-COV-2 (сочетающий гены rdrp и) имел с с с с с са са са са са са са се се не ное нае нае са се са са са са са са са с се се со са са са с се са са са (с 20 (20 ct) разз 87,6%, а значение Ct гена Orf1a/B в иследовании sansure Biotech 2019- анализ ncov показаз низкий ct. Come mostrato nella Figura 1, il test Abbott SARS-CoV-2 (che combina i geni RDRP e N) aveva il valore CT percentuale più basso (<20 CT) all'87,6%, mentre il valore CT del gene ORF1A/B nello studio sanscrito biotech 2019-l'analisi di NCOV ha mostrato un basso CT. Процент значений (<20 ct) сот л л 50,3%, а процент ыыык х значений Ct (36–40 ct) соттв л 3,2%. La percentuale di valori (<20 CT) era del 50,3%e la percentuale di valori CT elevati (36–40 CT) era del 3,2%.Il test Abbott SARS-CoV-2 B ha registrato valori CT superiori a 30. D'altra parte, sul test BGI SARS-CoV-2 ORF1a/B aveva un alto valore CT (> 36 CT) era il 4% (Fig. 1). D'altra parte, sul test BGI SARS-CoV-2 ORF1a/B aveva un alto valore CT (> 36 CT) era il 4% (Fig. 1). С дрйй стооы, а анализе bgi sars-cov-2 ген orf1a/b имел ы comune D'altra parte, nell'analisi del gene BGI SARS-CoV-2 ORF1A/B aveva un valore CT elevato (> 36 CT), la cui percentuale era del 4% (Fig. 1).另一方面 ， 在 BGI SARS-COV-2 检测中 ， ORF1A/B 基因具有高 CT 值 （> 36 ct ）的百分比为 4%（图 1 ）。 D'altra parte, nel rilevamento BGI SARS-CoV-2, la percentuale del gene ORF1A/B con un alto valore CT (> 36 CT) è del 4% (Figura 1). С дрйй стооы, а анализе bgi sars-cov-2 процент генов orf1a/b с ы ыыкими значения ct (> 36 ct) сот р р. 1). D'altra parte, nell'analisi BGI SARS-CoV-2, la percentuale di geni ORF1A/B con valori CT elevati (> 36 CT) era del 4% (Fig. 1).
In questo studio, abbiamo prelevato 164 campioni di rinofaringeo. Per tutti i tipi di test, l'isolamento e l'amplificazione dell'RNA sono stati eseguiti utilizzando i metodi e i kit raccomandati dai rispettivi produttori.
Questo studio ha dimostrato che il test di Abbott per SARS-Cov-2 ha le stesse prestazioni di rilevamento di CRS, con una concordanza positiva, negativa e complessiva al 100%. L'accordo Kappa di Cohen è 1,00, indicando il pieno accordo con CRS. Uno studio simile dell'Università di Washington negli Stati Uniti ha scoperto che la sensibilità complessiva e la specificità del test Abbott per SARS-COV-2 era rispettivamente del 93% e del 100%, rispetto al dosaggio (LDA) determinato da laboratorio (LDA) del CDC. 11. Il sistema di rilevamento Abbott SARS-COV-2 si basa sul rilevamento combinato simultaneo dei geni N e RDRP, poiché entrambi i geni sono più sensibili, minimizzando i falsi negativi12. Uno studio su Vienna, in Austria, ha anche dimostrato che i grandi volumi di campioni di estrazione e i volumi di eluenti di rilevamento hanno minimizzato gli effetti di diluizione e un aumento dell'efficienza di rilevamento13. Pertanto, la perfetta corrispondenza di Abbott per il test SARS-CoV-2 può essere associata a un sistema di rilevamento della piattaforma che rileva contemporaneamente i geni combinatori, estrae un gran numero di campioni (0,5 ml) e utilizza una grande quantità di eluenti (40 µL).
I nostri risultati hanno anche mostrato che le prestazioni di rilevamento del test genetico DAAN erano quasi le stesse di CRS. Ciò è coerente con uno studio14 condotto presso l'Università di Anhui a Huainan, in Cina, e la richiesta del produttore di accordo positivo al 100%. Nonostante i segnalazioni di risultati coerenti, un campione era falso negativo dopo aver provato lo stesso eluato, ma era positivo nei test Abbott SARS-COV-2 e Sansure Biotech NCOV-2019. Ciò suggerisce che potrebbe esserci variabilità nei risultati su diversi tipi di test. Tuttavia, nello studio condotto in China15, il risultato del dosaggio del gene DAAN era significativamente diverso (P <0,05) rispetto al loro test di riferimento definito da laboratorio. Tuttavia, nello studio condotto in China15, il risultato del dosaggio del gene DAAN era significativamente diverso (P <0,05) rispetto al loro test di riferimento definito da laboratorio. Тем не менее, в исловани9, проеденоistenza лабораторного эээного анализа. Tuttavia, in uno studio sulla Cina15, il risultato dell'analisi del gene Daan era significativamente diverso (P <0,05) dall'analisi di riferimento di laboratorio.然而 ， 在中国进行的研究中 15 ， 大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异 （P <0,05 ）。然而 ， 在中国进行的研究中 15 ， 大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差 <0,05 Однако в ислоовании, провен scart сравнению с е ээтон scart Tuttavia, in uno studio sulla Cina15, i risultati del test genetico di DAAN erano significativamente diversi (P <0,05) rispetto al suo test di laboratorio di riferimento.Questa discrepanza può essere dovuta alla sensibilità del test di riferimento per rilevare SARS-CoV-2 e ulteriori studi possono essere importanti per determinare la causa.
Inoltre, il nostro studio ha valutato le prestazioni comparative del test BGI SARS-CoV-2 con CRS, che mostra un eccellente accordo percentuale positivo (PPA = 97,9%), un accordo percentuale negativo (NPA = 100%) e un accordo percentuale complessivo di genere (OPA). ). = 98,8%). I valori di Kappa di Cohen hanno mostrato un buon accordo (k = 0,975). Studi nei Paesi Bassi16 e China15 hanno mostrato risultati coerenti. Il test BGI SARS-COV-2 è un singolo test di rilevamento del gene (ORF1A/B) utilizzando 10 µL di eluato di amplificazione/rilevamento. Nonostante un buon accordo statistico con i nostri risultati di riferimento, l'analisi ha perso due campioni positivi (1,22%) del campione totale. Ciò può avere enormi implicazioni cliniche per le dinamiche di trasmissione sia a livello di paziente che di comunità.
Un'altra analisi comparativa inclusa in questo studio è stato il test sansure Biotech NCOV-2019 RRT-PCR (Ruo); La percentuale complessiva della partita è stata del 96,3%. La forza dell'accordo è stata anche determinata dal valore Kappa di Cohen, che era 0,925, indicando il pieno accordo con il CRS. Ancora una volta, i nostri risultati sono identici agli studi condotti presso la Central South University di Changsha, in Cina, e presso il dipartimento clinico di laboratorio dell'ospedale popolare di Liuzhou, Città di Liuzhou, Cina17. Anche se è stata registrata la buona concordanza statistica di cui sopra, il test Chi-quadrato (Test Macnemar) ha mostrato che il risultato del test biotecnologica sanxure ha avuto una differenza statisticamente significativa rispetto al CRS (P <0,005). Anche se è stata registrata la buona concordanza statistica di cui sopra, il test Chi-quadrato (Test Macnemar) ha mostrato che il risultato del test biotecnologica sanxure ha avuto una differenza statisticamente significativa rispetto al CRS (P <0,005). " (критерий макемара) показ л, что резльтат анализа sansure biotech имет стати Rich 0,005). Sebbene sia stato registrato il buon accordo statistico sopra, il test Chi-quadrato (McNemar Test) ha mostrato che il risultato del dosaggio di biotecnologie sanscrite presentava una differenza statisticamente significativa rispetto al CRS (p <0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性 ， 但卡方检验 （MacNemar 检验）表明 ， Biotecnola sanxure 检测的结果与 CRS 相比具有统计学显着差异 （P <0,005 ）。尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（MACNEMAR 检验 表明 ， ， Biotecnologio sanscritto 检测 结果 CRS 相比 具有 显着 （（P <0,005 。。。。。。。。。。。。。。。。。。。）））） Несмотря на отеченное ыше хороше статистическое сответствие, критерий хи-к к к к к к ки-к к к к ки-к к к к ки-к к кхдртт крт крт молл статистически значимюю рзниц (p <0,005) между анализом sansure biotech и CRS. Nonostante il buon accordo statistico sopra indicato, il test Chi-quadrato (McNemar Test) ha mostrato una differenza statisticamente significativa (p <0,005) tra il test biotecnologio sanscritto e il CRS.Sei campioni (3,66%) sono risultati falsi negativi rispetto al CRS (Tabella supplementare 1); Questo è molto importante, soprattutto date le dinamiche della trasmissione del virus. I dati di cui sopra supportano anche questa bassa velocità di rilevamento15.
In questo studio, i valori CT sono stati determinati per ciascun dosaggio e rispettiva piattaforma, con il valore CT medio più basso riportato nel test Abbott SARS-CoV-2. Questo risultato può essere correlato al sistema di test genetici combinati simultanei di Abbott per il rilevamento di SARS-CoV-2. Pertanto, secondo la Figura 1, l'87,6% dei risultati di Abbott SARS-COV-2 presentava valori CT inferiori a 20. Solo un piccolo numero di risultati del campione (12,4%) era nell'intervallo 20-30. I valori CT superiori a 30 non sono stati registrati. Oltre all'uso da parte di Abbott del formato di test genetici del pannello SARS-CoV-2, questo risultato può essere correlato al limite di rilevamento inferiore (32,5 copie RNA/ml) 18, che è tre volte inferiore al limite inferiore della società di 100 copie RNA/ml. ML) 19.
Questo studio ha alcune limitazioni: in primo luogo, non disponiamo di metodi standard/di riferimento [come il carico virale o altri test di laboratorio (LDA)] a causa della mancanza di risorse. In secondo luogo, tutti i campioni utilizzati in questo studio erano tamponi rinofaringei, mentre i risultati non erano applicabili ad altri tipi di campioni e terzo, la nostra dimensione del campione era piccola.
Questo studio ha confrontato le prestazioni di quattro saggi RRT-PCR per SARS-CoV-2 usando campioni di rinofaringeo. Tutti i test di rilevamento avevano prestazioni quasi comparabili, ad eccezione del test biotecnologio sanscrito. Inoltre, il basso tasso di positività è stato identificato nel test biotecnologio sanscrito rispetto al CRS (p <0,05). Inoltre, il basso tasso di positività è stato identificato nel test biotecnologio sanscrito rispetto al CRS (p <0,05). Кроме того, в тесте sansure biotech был ыыы л низкий прцент положитель ых рллллттов по по по по по по по по по по по по по по пот по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по по omanda Inoltre, il test di biotecnologie sanxure ha mostrato una bassa percentuale di risultati positivi rispetto al CRS (P <0,05).此外 ， 与 CRS 相比 ， Biotecnola Sansura 检测的阳性率较低 (P <0,05)。此外 ， 与 CRS 相比 ， Biotecnola Sansura 检测的阳性率较低 (P <0,05)。 Кроме того, анализ sansure biotech имел более низкий уровень положles Inoltre, il dosaggio di biotecnologie sanxure aveva un tasso di positività inferiore rispetto al CRS (P <0,05).L'analisi NCOV-2019 di Sansure Biotech (Ruo) di PPA, NPA e accordo complessivo ha superato il 93,5% con una forza di Cohen Kappa del valore di accordo di 0,925. Infine, il saggio di biotecnologie Sansure (RUO) necessita di un'ulteriore validazione per l'uso in Etiopia e dovrebbero essere considerate ulteriori ricerche per valutare le affermazioni dei singoli produttori.
Il design comparativo dello studio è stato condotto presso quattro strutture sanitarie ad Addis Abeba, Eka Kotebe Hospital, Millennium Church Treatment Center, Zewooditu Memorial Hospital e St. Peter's Tuberculosis Specialist Hospital. I dati sono stati raccolti tra il 1 ° e il 31 dicembre 2020. Le strutture mediche per questo studio sono state scelte intenzionalmente in base al loro elevato numero di casi e alla disponibilità dei principali centri di trattamento in città. Allo stesso modo, gli strumenti, tra cui gli strumenti PCR in tempo reale ABI 7500 e Abbott M2000, sono stati selezionati secondo le raccomandazioni dei produttori di reagenti NAAT e per questo studio sono stati selezionati quattro kit di rilevamento della PCR, poiché la maggior parte dei laboratori in Etiopia ne usava almeno almeno quattro. Test genico, test Abbott SARS-COV-2, test biotecnologica sanxure e test BGI SARS-COV-2 eseguiti durante lo studio).
I test per SARS-CoV-2 sono stati eseguiti dal 1 al 30 dicembre 2020 utilizzando 3 ml di mezzo di trasporto virale (VTM) (MIRACLEAN TECNOLOGIA, SHENZHEN, CINA) da persone sotto inchiesta per Covid-19 di riferimento a EPI. I campioni di rinofaringeo sono stati raccolti da collezionisti di campioni addestrati e inviati a Ephi in tripli pacchetti. Prima dell'isolamento dell'acido nucleico, a ciascun campione viene assegnato un numero di identificazione univoco. L'estrazione viene eseguita da ciascun campione immediatamente all'arrivo usando metodi manuali e di estrazione automatica. Pertanto, per l'estrazione automatica di Abbott M2000, 1,3 ml (incluso il volume morto di 0,8 ml e il volume di ingresso di estrazione 0,5 ml) del campione è stata estratta da ciascun campione e passata attraverso il sistema di preparazione del campione di DNA di Abbott (Abbott Molecular Inc. Des Plains, IL, USA). ) Un batch di 96 [92 campioni, due controlli di rilevamento e due controlli non-tempicati (NTC)] è stato incluso nel processo complessivo (recupero e rilevazione) di due round di SARS-CoV-2 (EUA) in tempo reale. mining. Allo stesso modo, per l'estrazione manuale, utilizzare gli stessi campioni (per estrazione e scoperta automatica). Pertanto, durante il processo, 140 µl di campioni sono stati aliquotati ed estratti usando il mini kit Qiaamp virale RNA (Qiagen GmbH, Hilden, Germania) in lotti di 24 (tra cui 20 campioni, due controlli del test e due NTC) su nove colpi. Gli eluati estratti manualmente sono stati amplificati e rilevati utilizzando un cicle termico ABI 7500 usando il test BGI SARS-CoV-2, il test del gene DAAN e il test biotecnologio sanscritto.
L'isolamento automatizzato e la purificazione dell'RNA virale SARS-CoV-2 segue il principio del tallone magnetico usando i reagenti di preparazione del campione di DNA Abbott. L'inattivazione dei campioni e la solubilizzazione delle particelle virali viene effettuata utilizzando un detergente contenente isotiocianato di guanidina per denigrare la proteina e inattivare RNasi. L'RNA viene quindi separato dalla proteina mediante separazione di fase solida mediante silice, cioè il sale di guanidinio e il pH alcalino del tampone di lisi promuovono il legame degli acidi nucleici alla silice (SIO2). Il passaggio di risciacquo rimuove le proteine ​​e i detriti rimanenti per produrre una soluzione chiara. L'RNA trasparente è isolato da microparticelle a base di silice usando il campo magnetico dello strumento 20,21. D'altra parte, l'isolamento manuale e la purificazione dell'RNA vengono effettuati dal metodo della colonna di spin usando la centrifugazione anziché un supporto magnetico e una separazione delle microparticelle dall'eluente.
Il test di rilevamento SARS-CoV-2 Abbott in tempo reale (Abbott Molecular, Inc.) è stato eseguito secondo le istruzioni del produttore, che ha ricevuto EUA19,22 dall'OMS e dalla FDA. In questo protocollo, l'inattivazione del campione prima dell'estrazione è stata eseguita in un bagno d'acqua a 56 ° C per 30 minuti. Dopo l'inattivazione del virus, l'estrazione dell'acido nucleico è stata eseguita su uno strumento Abbott M2000 SP da 0,5 ml di VTM usando un sistema di preparazione del campione di DNA Abbott M2000. Secondo il produttore. L'amplificazione e il rilevamento sono stati eseguiti utilizzando uno strumento Abbott M2000 RT-PCR e è stato eseguito il doppio rilevamento per i geni RDRP e N. ROX) e Vic P (colorante proprietario) per il targeting e il rilevamento di controlli interni, consentendo il rilevamento simultaneo di entrambi i prodotti di amplificazione 19.
Il metodo di rilevamento dell'amplificazione di questo kit si basa sulla tecnologia RT-PCR in una fase. I geni ORF1A/B e N sono stati selezionati come regioni conservate dalla tecnologia del gene DAAN per rilevare l'amplificazione della regione target. Primer specifici e sonde fluorescenti (N geni etichettate con sonde FAM, ORF1A/B etichettate con VIC) sono stati progettati per rilevare l'RNA SARS-CoV-2 nei campioni. Le miscele finali eluenti e master sono state preparate aggiungendo 5 µl di eluente a 20 µl della miscela principale a un volume finale di 25 µL. L'amplificazione e il rilevamento sono stati eseguiti contemporaneamente su uno strumento PCR ABI 750024 in tempo reale.
I geni ORF1A/B e N sono stati rilevati utilizzando il kit diagnostico di acido nucleico NCOV-2019 sanscrito (rilevamento della PCR fluorescente). Preparare sonde specifiche per ciascun gene target selezionando il canale FAM per la regione ORF1A/B e il canale ROX per il gene N. A questo kit di dosaggio, i reagenti eluenti e master mix vengono aggiunti come segue: preparare 30 µl di reagente Master Mix e 20 µL di campione eluito per il rilevamento/amplificazione. PCR in tempo reale ABI 750025 è stato utilizzato per l'amplificazione/rilevamento.
Il test BGI SARS-CoV-2 è un kit RRT-PCR in tempo reale fluorescente per la diagnosi di Covid-19. La regione target si trova nella regione ORF1A/B del genoma SARS-CoV-2, che è un singolo metodo di rilevamento del gene. Inoltre, il gene β-actina di pulizia umana è un gene bersaglio regolato internamente. La miscela principale viene preparata miscelando 20 µL del reagente della miscela principale e 10 µL del campione di RNA estratto in una piastra Well26. Per l'amplificazione e il rilevamento sono stati utilizzati uno strumento PCR quantitativo quantitativo fluorescente ABI 7500. Tutta l'amplificazione dell'acido nucleico, le condizioni di gestione della PCR per ciascun test e l'interpretazione dei risultati sono state eseguite secondo le rispettive istruzioni del produttore (Tabella 3).
In questa analisi comparativa, non abbiamo utilizzato il metodo standard di riferimento per determinare l'accordo percentuale (positivo, negativo e complessivo) e altri parametri di confronto per le quattro analisi. Ogni confronto di test è stato eseguito con CRS, in questo studio il CRS è stato stabilito dalla regola "qualsiasi positivo" e il risultato è stato determinato, non da un singolo test, abbiamo usato almeno due risultati di test abbinati. Inoltre, nel caso della trasmissione di Covid-19, i risultati falsi negativi sono più pericolosi dei risultati falsi positivi. Pertanto, per dire "positivo" nel modo più accurato possibile da un risultato CRS, almeno due test di dosaggio devono essere positivi, il che significa che è probabile che almeno un risultato positivo provenga da un test EUA. Pertanto, su quattro risultati dei test, due o più risultati dei test che danno lo stesso risultato sono considerati veri positivi o negativi18,27.
I dati sono stati raccolti utilizzando moduli di estrazione dati strutturati, l'inserimento e l'analisi dei dati sono stati eseguiti utilizzando il software statistico Excel e la versione 23.0 SPSS per le statistiche descrittive. Sono stati analizzati un accordo positivo, negativo e complessivo percentuale e un punteggio Kappa è stato utilizzato per determinare il grado di accordo di ciascun metodo con CRS. I valori di kappa sono interpretati come segue: da 0,01 a 0,20 per un lieve accordo, da 0,21 a 0,40 per accordo generale, 0,41-0,60 per un accordo moderato, 0,61-0,80 per accordo maggiore e 0,81-0,99 per un accordo completo28.
L'autorizzazione etica è stata ottenuta dall'Università di Addis Abeba e tutti i protocolli sperimentali per questo studio sono stati approvati dal comitato di revisione etica scientifica dell'Istituto pubblico etiope. Il numero di riferimento per la licenza etica EPhi è EPHI/IRB-279-2020. Tutti i metodi sono stati applicati in conformità con le raccomandazioni e le disposizioni delle linee guida globali nazionali etiopi per il trattamento di Covid-19. Inoltre, il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti allo studio prima della partecipazione allo studio.
Tutti i dati ottenuti o analizzati in questo studio sono inclusi in questo articolo pubblicato. I dati a supporto dei risultati di questo studio sono disponibili dal rispettivo autore su ragionevole richiesta.
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