Esecuzione di quattro test di amplificazione degli acidi nucleici per identificare il SARS-CoV-2 in Etiopia

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Dall'inizio dell'epidemia di coronavirus (COVID-19) del 2019, in tutto il mondo sono stati sviluppati numerosi test commerciali di amplificazione degli acidi nucleici (NAAT), che sono diventati test standard. Sebbene diversi test siano stati rapidamente sviluppati e applicati a test diagnostici di laboratorio, le loro prestazioni non sono state valutate in diversi contesti. Pertanto, questo studio si è proposto di valutare le prestazioni dei test Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI e Sansure Biotech utilizzando lo standard di riferimento composito (CRS). Lo studio è stato condotto presso l'Istituto di sanità pubblica etiope (EPHI) dall'1 al 30 dicembre 2020. 164 campioni nasofaringei sono stati estratti utilizzando il mini kit QIAamp RNA e il sistema di preparazione dei campioni di DNA Abbott. Dei 164 campioni, il 59,1% è risultato positivo e il 40,9% negativo al CRS. La positività di Sansure Biotech è stata significativamente bassa rispetto a CRS (p < 0,05). La positività di Sansure Biotech è stata significativamente bassa rispetto a CRS (p < 0,05). I risultati del sondaggio Sansure Biotech non hanno ottenuto risultati soddisfacenti con CRS (p < 0,05). I risultati positivi di Sansure Biotech sono stati significativamente inferiori rispetto a CRS (p < 0,05).Secondo CRS, Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0.05）.Secondo CRS, Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0.05）. Sansure Biotech ha ottenuto un numero medio di risultati positivi rispetto al CRS (p < 0,05). Sansure Biotech ha avuto significativamente meno risultati positivi rispetto a CRS (p < 0,05).La concordanza complessiva delle quattro analisi è stata del 96,3-100% rispetto alla CRS. Oltre al basso tasso di positività del test Sansure Biotech, le prestazioni dei quattro test sono state pressoché comparabili. Pertanto, il test Sansure Biotech [Research Only (RUO)] richiede un'ulteriore convalida per il suo utilizzo in Etiopia. Infine, si dovrebbero prendere in considerazione ulteriori ricerche per valutare i test con le dichiarazioni del produttore appropriate.
I test di laboratorio fanno parte del Piano Strategico per la Preparazione e la Risposta alla Malattia da Coronavirus 2019 (COVID-19) (SPRP) dell'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS). L'OMS raccomanda ai paesi di rafforzare le capacità di laboratorio per migliorare la preparazione, la corretta gestione dei casi, la vigilanza e la risposta rapida alle sfide di salute pubblica. Ciò suggerisce che il ruolo del laboratorio è fondamentale per caratterizzare la malattia e l'epidemiologia degli agenti infettivi emergenti e controllarne la diffusione.
La diagnosi di COVID-19 richiede informazioni epidemiologiche e mediche, sintomi/segni personali e dati radiografici e di laboratorio2. Da quando l'epidemia di COVID-19 è stata segnalata a Wuhan, in Cina, sono stati sviluppati molti test commerciali di amplificazione degli acidi nucleici (NAAT) in tutto il mondo. La reazione a catena della polimerasi con trascrizione inversa in tempo reale (rRT-PCR) è stata utilizzata come metodo di routine e standard per la diagnosi di laboratorio dell'infezione da sindrome respiratoria acuta grave 2 (SARS-CoV-2)3. Il rilevamento molecolare di SARS-CoV-2 si basa in genere sui geni N (gene della proteina nucleocapside), E (gene della proteina envelope) e RdRp (gene della RNA polimerasi RNA-dipendente) nella regione ORF1a/b (gene open reading frame 1a/b) identificati nel genoma virale. Sono considerate le principali regioni conservate presenti nei genomi virali per il riconoscimento del virus4. Tra questi geni, i geni RdRp ed E hanno un'elevata sensibilità di rilevamento analitico, mentre il gene N ha una bassa sensibilità analitica5.
Le prestazioni dei test PCR possono variare a seconda di diversi fattori, tra cui: reagenti di estrazione, reagenti di amplificazione/rilevazione, metodo di estrazione, qualità della macchina PCR e altri strumenti. Ad aprile 2020, oltre 48 diversi dispositivi diagnostici provenienti da nove paesi hanno ricevuto l'autorizzazione all'uso di emergenza (EUA) per la diagnosi di COVID-196. In Etiopia, oltre 14 piattaforme PCR in tempo reale vengono utilizzate per il rilevamento PCR di SARS-CoV-2 presso 26 istituzioni sanitarie pubbliche, tra cui ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 e Quant-studio7. Sono inoltre disponibili diversi kit per test PCR, come il test Daan Gene, il test Abbott SARS-CoV-2, il test Sansure Biotech e il test SARS-CoV-2 BGI. Sebbene la rRT-PCR sia altamente sensibile, alcuni pazienti con COVID-19 riportano risultati falsi negativi a causa di copie insufficienti di acido ribonucleico (RNA) virale nei campioni a causa di raccolta, trasporto, conservazione e manipolazione impropri, nonché di test di laboratorio, condizioni e azioni del personale8. Inoltre, la manipolazione errata di campioni o controlli, l'impostazione della soglia del ciclo (Ct) e la reattività crociata con altri acidi nucleici patogeni o RNA inattivo/residuo di SARS-CoV-2 possono portare a risultati falsi positivi nei test rRT-PCR9. Pertanto, è chiaro che i test PCR possono effettivamente identificare i portatori di frammenti genici, poiché non possono nemmeno distinguere tra geni virali realmente attivi, quindi i test possono identificare solo i portatori e non i pazienti10. Pertanto, è importante valutare le prestazioni diagnostiche utilizzando metodi standard nel nostro contesto. Sebbene molti reagenti NAAT siano disponibili presso l'Istituto di Sanità Pubblica Etiope (EPHI) e in tutto il paese, non è stata ancora riportata alcuna valutazione comparativa della loro efficacia. Pertanto, questo studio mirava a valutare le prestazioni comparative dei kit disponibili in commercio per il rilevamento del SARS-CoV-2 mediante rRT-PCR utilizzando campioni clinici.
In questo studio sono stati inclusi 164 partecipanti con sospetto COVID-19. La maggior parte dei campioni proveniva da centri di trattamento (118/164 = 72%), mentre i restanti 46 partecipanti (28%) provenivano da centri non di trattamento. Tra i partecipanti non trattati presso il centro, 15 (9,1%) presentavano casi clinicamente sospetti e 31 (18,9%) avevano contatti con casi confermati. Novantatré (56,7%) partecipanti erano di sesso maschile e l'età media (± DS) dei partecipanti era di 31,10 (± 11,82) anni.
In questo studio, sono stati determinati i tassi di positività e negatività di quattro test per COVID-19. Pertanto, i tassi di positività del test Abbott SARS-CoV-2, del test Daan Gene 2019-nCoV, del test SARS-CoV-2 BGI e del test Sansure Biotech 2019-nCoV sono stati rispettivamente del 59,1%, 58,5%, 57,9% e 55,5%. I punteggi positivi e negativi dello standard di riferimento composito (CRS) sono stati rispettivamente di 97 (59,1%) e 67 (40,9%) (Tabella 1). In questo studio, la definizione di CRS si basava sulla regola "qualsiasi risultato positivo", in base alla quale, su quattro risultati di test, due o più risultati che fornivano lo stesso risultato venivano considerati veri positivi o negativi.
In questo studio, abbiamo riscontrato una concordanza percentuale negativa (NPA) del 100% (IC al 95% 94,6-100) per tutte le analisi rispetto al CRS. L'analisi di Sansure Biotechnology ha mostrato una PPA minima del 93,8% (IC al 95% 87,2-97,1) e l'analisi di Daan Gene 2019-nCoV ha mostrato una concordanza complessiva del 99,4% (IC al 95% 96,6-99,9). Al contrario, la concordanza complessiva tra il test SARS-CoV-2 BGI e il test Sansure Biotech 2019-nCoV è stata rispettivamente del 98,8% e del 96,3% (Tabella 2).
Il coefficiente di concordanza kappa di Cohen tra i risultati del test CRS e quelli del test Abbott SARS-CoV-2 è risultato pienamente coerente (K = 1,00). Analogamente, i valori kappa di Cohen rilevati da Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI e Sansure Biotech 2019-nCoV sono anch'essi pienamente coerenti con i risultati del test CRS (K ≥ 0,925). In questa analisi comparativa, il test del chi-quadrato (test di McNemar) ha mostrato che i risultati del test Sansure Biotech 2019-nCoV erano significativamente diversi dai risultati del test CRS (p = 0,031) (Tabella 2).
Come mostrato nella Fig.1 la percentuale del valore Ct più basso (< 20 Ct) del test Abbott SARS-CoV-2 (gene RdRp e N combinati) era dell'87,6% e il valore Ct del gene ORF1a/b del test Sansure Biotech 2019-nCoV ha mostrato che la percentuale del valore Ct basso (< 20 Ct) era del 50,3% e il valore Ct alto (36–40 Ct) era del 3,2%. 1 la percentuale del valore Ct più basso (< 20 Ct) del test Abbott SARS-CoV-2 (gene RdRp e N combinati) era dell'87,6% e il valore Ct del gene ORF1a/b del test Sansure Biotech 2019-nCoV ha mostrato che la percentuale del valore Ct basso (< 20 Ct) era del 50,3% e il valore Ct alto (36–40 Ct) era del 3,2%.Come mostrato nella Fig.1, l'analisi basata sul nome Ct (< 20 Ct) di Abbott SARS-CoV-2 (combinazione genetica RdRp e N) è stata sostenuta dall'87,6%, analisi del valore Ct della generazione ORF1a/b Sansure Biotech 2019-nCoV il tasso di Ct inferiore a 20 Ct (< 20 Ct) è stato mantenuto al 50,3%, mentre il Ct a livello elevato (36-40 Ct) è stato mantenuto al 3,2%. 1, la percentuale del valore Ct più basso (< 20 Ct) dell'analisi di Abbott SARS-CoV-2 (gene combinato RdRp e N) era dell'87,6% e il valore Ct dell'analisi del gene ORF1a/b di Sansure Biotech 2019-nCoV ha mostrato che la percentuale di valore Ct basso (< 20 Ct) rappresentava il 50,3% e il valore Ct alto (36–40 Ct) rappresentava il 3,2%.如图1 所示, Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比（< 20 Ct）为87.6%, Sansure Biotech 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3%, 高Ct 值(36–40 Ct) percentuale di sconto del 3,2%. Come mostrato nella Figura 1, la percentuale del valore Ct più basso (< 20 Ct) del test Abbott SARS-CoV-2 (combinazione di RdRp e gene N) è dell'87,6%, il valore Ct del gene ORF1a/b del test Sansure Biotech 2019-nCoV mostra una bassa percentuale di Ct (< 20 Ct) pari al 50,3%, e la percentuale di Ct basso (36–40 Ct) pari al 3,2%. Come riscontrato nel rischio 1, l'analisi di Abbott SARS-CoV-2 (generi RdRp e N) ha avuto un livello di Ct non significativo (< 20 Ct) nel diametro 87,6%, un Ct di valore гена ORF1a/b in исследовании Sansure Biotech 2019- Анализ nCoV показал низкий Ct. Come mostrato nella Figura 1, il test Abbott SARS-CoV-2 (che combina i geni RdRp e N) ha avuto la percentuale più bassa di valore Ct (< 20 Ct) all'87,6%, mentre il valore Ct del gene ORF1a/b nello studio Sansure Biotech 2019 – L'analisi di nCoV ha mostrato un Ct basso. Il professionista esperto (< 20 Ct) è stato sostenuto dal 50,3%, mentre il professionista esperto (< 20 Ct) è stato sostenuto dal 3,2%. La percentuale di valori (< 20 Ct) è stata del 50,3% e la percentuale di valori Ct elevati (36–40 Ct) è stata del 3,2%.Il test Abbott SARS-CoV-2 B ha registrato valori Ct superiori a 30. D'altra parte, nel test BGI SARS-CoV-2 il gene ORF1a/b aveva un valore Ct elevato (> 36 Ct), la percentuale era del 4% (Fig. 1). D'altra parte, nel test BGI SARS-CoV-2 il gene ORF1a/b aveva un valore Ct elevato (> 36 Ct), la percentuale era del 4% (Fig. 1). Con un'altra pietra miliare, nell'analisi del gene BGI SARS-CoV-2 ORF1a/b, il valore elevato di Ct (> 36 Ct), il proprietario dell'azienda ha mantenuto il 4% (Risma 1). D'altra parte, nell'analisi del gene SARS-CoV-2 BGI ORF1a/b aveva un valore Ct elevato (> 36 Ct), la cui percentuale era del 4% (Fig. 1).另一方面,在BGI SARS-CoV-2 检测中,ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比为4%（图1）. D'altro canto, nel rilevamento BGI SARS-CoV-2, la percentuale del gene ORF1a/b con valore Ct elevato (>36 Ct) è del 4% (Figura 1). In altre circostanze, l'analisi del prototipo BGI SARS-CoV-2 del gene ORF1a/b con i valori Ct (>36 Ct) è stata del 4% (rischio 1). D'altra parte, nell'analisi BGI SARS-CoV-2, la percentuale di geni ORF1a/b con valori Ct elevati (>36 Ct) era del 4% (Fig. 1).
In questo studio, abbiamo prelevato 164 campioni nasofaringei. Per tutti i tipi di test, l'isolamento e l'amplificazione dell'RNA sono stati eseguiti utilizzando i metodi e i kit raccomandati dai rispettivi produttori.
Questo studio ha dimostrato che il test Abbott per SARS-CoV-2 ha le stesse prestazioni di rilevamento del CRS, con il 100% di concordanza positiva, negativa e complessiva. La concordanza kappa di Cohen è 1,00, indicando una piena concordanza con il CRS. Uno studio simile dell'Università di Washington negli Stati Uniti ha rilevato che la sensibilità e la specificità complessive del test Abbott per SARS-CoV-2 erano rispettivamente del 93% e del 100%, rispetto al test determinato in laboratorio (LDA) del CDC. 11. Il sistema di rilevamento Abbott per SARS-CoV-2 si basa sul rilevamento combinato simultaneo dei geni N e RdRp, poiché entrambi i geni sono più sensibili, riducendo al minimo i falsi negativi12. Uno studio condotto a Vienna, in Austria, ha inoltre dimostrato che grandi volumi di campione di estrazione e volumi di eluente di rilevamento hanno ridotto al minimo gli effetti di diluizione e aumentato l'efficienza di rilevamento13. Pertanto, la soluzione perfetta di Abbott per il test SARS-CoV-2 può essere associata a un sistema di rilevamento della piattaforma che rileva simultaneamente geni combinatori, estrae un gran numero di campioni (0,5 ml) e utilizza una grande quantità di eluente (40 µl).
I nostri risultati hanno inoltre mostrato che le prestazioni di rilevamento del test genetico Daan erano pressoché identiche a quelle del CRS. Ciò è coerente con uno studio14 condotto presso l'Università di Anhui a Huainan, in Cina, e con la dichiarazione del produttore di una concordanza positiva del 100%. Nonostante i risultati riportati siano stati coerenti, un campione è risultato falso negativo dopo aver ritestato lo stesso eluato, ma è risultato positivo nei test Abbott SARS-CoV-2 e Sansure Biotech nCoV-2019. Ciò suggerisce che potrebbe esserci variabilità nei risultati tra i diversi tipi di test. Tuttavia, nello studio condotto in Cina15, il risultato del test Daan Gene è risultato significativamente diverso (p < 0,05) rispetto al test di riferimento definito in laboratorio. Tuttavia, nello studio condotto in Cina15, il risultato del test Daan Gene è risultato significativamente diverso (p < 0,05) rispetto al test di riferimento definito in laboratorio. Ciò non significa, nell'analisi provata in Cina15, il risultato dell'analisi di Daan Gene è stato escluso (p < 0,05) da il mio laboratorio artigianale analizaz. Tuttavia, in uno studio condotto in Cina15, il risultato dell'analisi di Daan Gene era significativamente diverso (p < 0,05) dall'analisi di riferimento del loro laboratorio.然而,在中国进行的研究中15,大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p < 0,05）。Vedi l'originale 15与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 I risultati del test genetico di Daan sono stati eliminati (p < 0,05) по сравнению сего testo di laboratorio completo. Tuttavia, in uno studio condotto in Cina15, i risultati del test genetico di Daan erano significativamente diversi (p < 0,05) rispetto al test di laboratorio di riferimento.Questa discrepanza potrebbe essere dovuta alla sensibilità del test di riferimento nel rilevare il SARS-CoV-2 e potrebbero essere importanti ulteriori studi per determinarne la causa.
Inoltre, il nostro studio ha valutato le prestazioni comparative del test SARS-CoV-2 BGI con CRS, mostrando un'eccellente concordanza percentuale positiva (PPA = 97,9%), concordanza percentuale negativa (NPA = 100%) e concordanza percentuale complessiva per genere (OPA). = 98,8%). I valori Kappa di Cohen hanno mostrato una buona concordanza (K = 0,975). Studi nei Paesi Bassi16 e in Cina15 hanno mostrato risultati coerenti. Il test SARS-CoV-2 BGI è un test di rilevamento di un singolo gene (ORF1a/b) che utilizza 10 µl di eluato di amplificazione/rilevazione. Nonostante una buona concordanza statistica con i nostri risultati di riferimento, l'analisi ha omesso due campioni positivi (1,22%) del campione totale. Ciò può avere enormi implicazioni cliniche per le dinamiche di trasmissione sia a livello di paziente che di comunità.
Un'altra analisi comparativa inclusa in questo studio è stata il test nCoV-2019 rRT-PCR (RUO) di Sansure Biotech; la percentuale di corrispondenza complessiva è stata del 96,3%. Il grado di concordanza è stato determinato anche dal valore Kappa di Cohen, che era 0,925, indicando una piena concordanza con il CRS. Anche in questo caso, i nostri risultati sono identici a quelli degli studi condotti presso la Central South University di Changsha, in Cina, e presso il Dipartimento di Laboratorio Clinico dell'Ospedale Popolare di Liuzhou, nella città di Liuzhou, in Cina17. Nonostante sia stata registrata la buona concordanza statistica di cui sopra, il test del chi-quadrato (test di MacNemar) ha mostrato che il risultato del test Sansure Biotech ha avuto una differenza statisticamente significativa rispetto al CRS (p < 0,005). Nonostante sia stata registrata la buona concordanza statistica di cui sopra, il test del chi-quadrato (test di MacNemar) ha mostrato che il risultato del test Sansure Biotech ha avuto una differenza statisticamente significativa rispetto al CRS (p < 0,005). Non so cosa è successo con la tua migliore statistica statistica, i criteri di classificazione (criterio Maknemara) ad esempio, il risultato dell'analisi di Sansure Biotech presenta una statistica statistica basata sul CRS (p < 0,005). Nonostante sia stata registrata una buona concordanza statistica, il test del chi-quadrato (test di McNemar) ha mostrato che il risultato del test Sansure Biotech presentava una differenza statisticamente significativa rispetto al CRS (p < 0,005).Per saperne di più, vedere l'articolo su MacNemar, Sansure Biotech 检测的结果与CRS相比具有统计学显着差异（p < 0.005）.尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性, 但 检验 （（（macnemar 检验 表明, sansure biotech 检测 结果 与 crs相比 具有 显着 （（p <0.005。。。。。。。。。。。。。。。。。。）））） Il problema della tua migliore statistica statistica è stato visualizzato sui criteri di classificazione (criteri di Maknemara) statistici значимую разницу (p < 0,005) tramite l'analisi di Sansure Biotech e CRS. Nonostante il buon accordo statistico sopra menzionato, il test del chi-quadrato (test di McNemar) ha mostrato una differenza statisticamente significativa (p < 0,005) tra il test Sansure Biotech e il CRS.Sei campioni (3,66%) sono risultati falsi negativi rispetto alla CRS (Tabella supplementare 1); questo è molto importante, soprattutto considerando le dinamiche di trasmissione del virus. I dati sopra riportati confermano anche questo basso tasso di rilevamento15.
In questo studio, i valori di Ct sono stati determinati per ciascun test e per la rispettiva piattaforma, con il valore medio di Ct più basso riportato nel test Abbott SARS-CoV-2. Questo risultato potrebbe essere correlato al sistema di test genetici combinati simultanei di Abbott per il rilevamento di SARS-CoV-2. Pertanto, secondo la Figura 1, l'87,6% dei risultati di Abbott SARS-CoV-2 presentava valori di Ct inferiori a 20. Solo un piccolo numero di risultati del campione (12,4%) rientrava nell'intervallo 20-30. I valori di Ct superiori a 30 non sono stati registrati. Oltre all'utilizzo da parte di Abbott del formato del test genetico del pannello SARS-CoV-2, questo risultato potrebbe essere correlato al limite inferiore di rilevamento (32,5 copie di RNA/mL)18, che è tre volte inferiore al limite inferiore di 100 copie di RNA/mL (ml)19.
Questo studio presenta alcune limitazioni: in primo luogo, non disponiamo di metodi standard/di riferimento [come la carica virale o altri test di laboratorio (LDA)] a causa della mancanza di risorse. In secondo luogo, tutti i campioni utilizzati in questo studio erano tamponi nasofaringei, mentre i risultati non erano applicabili ad altri tipi di campioni; in terzo luogo, il nostro campione era di piccole dimensioni.
Questo studio ha confrontato le prestazioni di quattro test rRT-PCR per SARS-CoV-2 su campioni nasofaringei. Tutti i test di rilevamento hanno mostrato prestazioni pressoché comparabili, ad eccezione del test Sansure Biotech. Inoltre, è stato identificato un basso tasso di positività nel test Sansure Biotech rispetto al CRS (p < 0,05). Inoltre, è stato identificato un basso tasso di positività nel test Sansure Biotech rispetto al CRS (p < 0,05). Inoltre, il test Sansure Biotech ha ottenuto i risultati del test CRS (p < 0,05). Inoltre, il test Sansure Biotech ha mostrato una bassa percentuale di risultati positivi rispetto al CRS (p < 0,05).Secondo CRS, Sansure Biotech ha ottenuto risultati positivi (p < 0,05).Secondo CRS, Sansure Biotech ha ottenuto risultati positivi (p < 0,05). Inoltre, l'analisi di Sansure Biotech ha evidenziato i risultati più positivi ottenuti con CRS (p < 0,05). Inoltre, il test Sansure Biotech ha avuto un tasso di positività inferiore rispetto al CRS (p < 0,05).L'analisi di Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) relativa a PPA, NPA e concordanza complessiva ha superato il 93,5%, con un valore di concordanza Cohen Kappa pari a 0,925. Infine, il test Sansure Biotech (RUO) necessita di ulteriore convalida per l'uso in Etiopia e sono necessarie ulteriori ricerche per valutare le dichiarazioni dei singoli produttori.
Lo studio comparativo è stato condotto presso quattro strutture sanitarie di Addis Abeba: l'ospedale Eka Kotebe, il Millennium Church Treatment Centre, lo Zewooditu Memorial Hospital e il St. Peter's Tuberculosis Specialist Hospital. I dati sono stati raccolti tra il 1° e il 31 dicembre 2020. Le strutture mediche per questo studio sono state appositamente selezionate in base all'elevato numero di casi e alla disponibilità dei principali centri di trattamento in città. Analogamente, gli strumenti, tra cui gli strumenti ABI 7500 e Abbott m2000 per PCR in tempo reale, sono stati selezionati in base alle raccomandazioni dei produttori di reagenti NAAT, e per questo studio sono stati selezionati quattro kit di rilevamento PCR, poiché la maggior parte dei laboratori in Etiopia ne utilizzava almeno quattro. Test genetico, test Abbott SARS-CoV-2, test Sansure Biotech e test SARS-CoV-2 BGI eseguiti durante lo studio.
I test per SARS-CoV-2 sono stati eseguiti dal 1° al 30 dicembre 2020 utilizzando 3 ml di Viral Transport Medium (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, Cina) da individui sottoposti a indagine per COVID-19 inviati all'EPHI. I campioni nasofaringei sono stati raccolti da personale qualificato e inviati all'EPHI in confezioni triple. Prima dell'isolamento degli acidi nucleici, a ciascun campione viene assegnato un numero identificativo univoco. L'estrazione viene eseguita da ciascun campione immediatamente all'arrivo utilizzando metodi di estrazione manuali e automatici. Pertanto, per l'estrazione automatica di Abbott m2000, 1,3 ml (inclusi 0,8 ml di volume morto e 0,5 ml di volume di ingresso dell'estrazione) del campione sono stati estratti da ciascun campione e passati attraverso il sistema di preparazione dei campioni di DNA Abbott (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, USA). ) Un lotto di 96 [92 campioni, due controlli di rilevamento e due controlli non templato (NTC)] è stato incluso nel processo complessivo (recupero e rilevamento) di due cicli di analisi di SARS-CoV-2 (EUA) in tempo reale. Analogamente, per l'estrazione manuale, utilizzare gli stessi campioni (per l'estrazione e la scoperta automatiche). Pertanto, durante l'intero processo, 140 µl di campioni sono stati aliquotati ed estratti utilizzando il kit QIAamp Viral RNA Mini (QIAGEN GmbH, Hilden, Germania) in lotti di 24 (inclusi 20 campioni, due controlli di analisi e due NTC) in nove cicli. Gli eluati estratti manualmente sono stati amplificati e rilevati utilizzando un termociclatore ABI 7500 utilizzando il test SARS-CoV-2 BGI, il test Daan Gene e il test Sansure Biotech.
L'isolamento e la purificazione automatizzati dell'RNA virale SARS-CoV-2 seguono il principio delle biglie magnetiche utilizzando i reagenti per la preparazione dei campioni di DNA Abbott. L'inattivazione dei campioni e la solubilizzazione delle particelle virali vengono eseguite utilizzando un detergente contenente isotiocianato di guanidina per denaturare la proteina e inattivare l'RNasi. L'RNA viene quindi separato dalla proteina mediante separazione in fase solida utilizzando silice, ovvero il sale di guanidinio e il pH alcalino del tampone di lisi promuovono il legame degli acidi nucleici alla silice (SiO₂). La fase di risciacquo rimuove le proteine ​​e i detriti rimanenti per produrre una soluzione limpida. L'RNA trasparente viene isolato dalle microparticelle a base di silice utilizzando il campo magnetico dello strumento20,21. D'altra parte, l'isolamento e la purificazione manuali dell'RNA vengono eseguiti con il metodo della colonna spin utilizzando la centrifugazione anziché un supporto magnetico e la separazione delle microparticelle dall'eluente.
Il test di rilevamento Abbott Real-Time SARS-CoV-2 (Abbott Molecular, Inc.) è stato eseguito secondo le istruzioni del produttore, che ha ricevuto l'autorizzazione all'uso (EUA)19,22 dall'OMS e dalla FDA. In questo protocollo, l'inattivazione del campione prima dell'estrazione è stata eseguita in un bagno d'acqua a 56 °C per 30 minuti. Dopo l'inattivazione del virus, l'estrazione dell'acido nucleico è stata eseguita su uno strumento Abbott m2000 SP da 0,5 ml di VTM utilizzando un sistema di preparazione del campione di DNA Abbott m2000, secondo le istruzioni del produttore. L'amplificazione e il rilevamento sono stati eseguiti utilizzando uno strumento Abbott m2000 RT-PCR, ed è stata eseguita una doppia rilevazione per i geni RdRp e N. ROX) e VIC P (colorante proprietario) per il targeting e il rilevamento dei controlli interni, consentendo il rilevamento simultaneo di entrambi i prodotti di amplificazione 19 .
Il metodo di rilevazione dell'amplificazione di questo kit si basa sulla tecnologia RT-PCR one-step. I geni ORF1a/b e N sono stati selezionati come regioni conservate da Daan Gene Technology per rilevare l'amplificazione della regione target. Primer specifici e sonde fluorescenti (sonde per i geni N marcate con FAM, sonde per ORF1a/b marcate con VIC) sono stati progettati per rilevare l'RNA di SARS-CoV-2 nei campioni. L'eluente finale e le master mix sono stati preparati aggiungendo 5 µl di eluente a 20 µl di master mix, fino a un volume finale di 25 µl. L'amplificazione e la rilevazione sono state eseguite simultaneamente su uno strumento per PCR in tempo reale ABI 750024.
I geni ORF1a/b e N sono stati rilevati utilizzando il kit diagnostico per acidi nucleici nCoV-2019 di Sansure Biotech (rilevamento tramite PCR fluorescente). Preparare sonde specifiche per ciascun gene target selezionando il canale FAM per la regione ORF1a/b e il canale ROX per il gene N. A questo kit di analisi, vengono aggiunti i reagenti eluente e master mix come segue: preparare 30 µl di master mix e 20 µl di campione eluito per la rilevazione/amplificazione. Per l'amplificazione/rilevazione è stata utilizzata la PCR real-time ABI 750025.
Il test SARS-CoV-2 BGI è un kit rRT-PCR fluorescente in tempo reale per la diagnosi di COVID-19. La regione target si trova nella regione ORF1a/b del genoma di SARS-CoV-2, che è un metodo di rilevamento a singolo gene. Inoltre, il gene umano housekeeping β-actina è un gene target regolato internamente. La master mix viene preparata mescolando 20 µl del reagente master mix e 10 µl del campione di RNA estratto in una piastra a pozzetti26. Per l'amplificazione e il rilevamento è stato utilizzato uno strumento ABI 7500 per PCR quantitativa fluorescente in tempo reale. Tutte le operazioni di amplificazione degli acidi nucleici, le condizioni di esecuzione della PCR per ciascun test e l'interpretazione dei risultati sono state eseguite secondo le istruzioni del rispettivo produttore (Tabella 3).
In questa analisi comparativa, non abbiamo utilizzato il metodo dello standard di riferimento per determinare la percentuale di concordanza (positiva, negativa e complessiva) e altri parametri di confronto per le quattro analisi. Ogni confronto tra test è stato effettuato con CRS; in questo studio, il CRS è stato impostato sulla regola "qualsiasi positivo" e il risultato è stato determinato, non da un singolo test; abbiamo utilizzato almeno due risultati di test abbinati. Inoltre, nel caso della trasmissione di COVID-19, i risultati falsi negativi sono più pericolosi dei risultati falsi positivi. Pertanto, per affermare "positivo" nel modo più accurato possibile da un risultato CRS, almeno due test di dosaggio devono essere positivi, il che significa che è probabile che almeno un risultato positivo provenga da un test EUA. Pertanto, su quattro risultati di test, due o più risultati di test che danno lo stesso risultato sono considerati veri positivi o negativi18,27.
I dati sono stati raccolti utilizzando moduli di estrazione dati strutturati, l'inserimento e l'analisi dei dati sono stati eseguiti utilizzando il software statistico Excel e SPSS versione 23.0 per le statistiche descrittive. Sono state analizzate le percentuali di concordanza positiva, negativa e complessiva, ed è stato utilizzato un punteggio Kappa per determinare il grado di concordanza di ciascun metodo con la CRS. I valori Kappa sono interpretati come segue: da 0,01 a 0,20 per concordanza lieve, da 0,21 a 0,40 per concordanza generale, da 0,41 a 0,60 per concordanza moderata, da 0,61 a 0,80 per concordanza maggiore e da 0,81 a 0,99 per concordanza completa28.
L'autorizzazione etica è stata ottenuta dall'Università di Addis Abeba e tutti i protocolli sperimentali per questo studio sono stati approvati dal Comitato di Revisione Etica Scientifica dell'Istituto di Sanità Pubblica Etiope. Il numero di riferimento per la Licenza Etica EPHI è EPHI/IRB-279-2020. Tutti i metodi sono stati applicati in conformità con le raccomandazioni e le disposizioni delle Linee Guida Nazionali Complete Etiopi per il Trattamento del COVID-19. Inoltre, è stato ottenuto il consenso informato scritto da tutti i partecipanti allo studio prima della loro partecipazione.
Tutti i dati ottenuti o analizzati in questo studio sono inclusi nel presente articolo pubblicato. I dati a supporto dei risultati di questo studio sono disponibili presso i rispettivi autori su ragionevole richiesta.
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