Esecuzione di quattro test di amplificazione dell'acido nucleico per identificare SARS-CoV-2 in Etiopia

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Dall'epidemia di coronavirus del 2019 (COVID-19), molti test commerciali di amplificazione dell'acido nucleico (NAAT) sono stati sviluppati in tutto il mondo e sono diventati test standard.Sebbene diversi test siano stati rapidamente sviluppati e applicati ai test diagnostici di laboratorio, le prestazioni di questi test non sono state valutate in una varietà di contesti.Pertanto, questo studio mirava a valutare le prestazioni dei test Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI e Sansure Biotech utilizzando il Composite Reference Standard (CRS).Lo studio è stato condotto presso l'Ethiopian Public Health Institute (EPHI) dal 1° al 30 dicembre 2020. 164 campioni nasofaringei sono stati estratti utilizzando il mini kit QIAamp RNA e il sistema di preparazione del campione di DNA Abbott.Dei 164 campioni, il 59,1% era positivo e il 40,9% negativo per CRS. La positività di Sansure Biotech era significativamente bassa rispetto a CRS (p <0,05). La positività di Sansure Biotech era significativamente bassa rispetto a CRS (p <0,05). I risultati polosi di Sansure Biotech non sono stati valutati a causa di CRS (p < 0,05). I risultati positivi di Sansure Biotech sono stati significativamente inferiori rispetto a CRS (p < 0,05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0.05）.与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0.05）. Sansure Biotech ha ottenuto meno risultati positivi da parte dei centri di ricerca (p < 0,05). Sansure Biotech ha avuto un numero significativamente inferiore di risultati positivi rispetto a CRS (p <0,05).La concordanza complessiva delle quattro analisi è stata del 96,3-100% rispetto alla CRS.Oltre al basso tasso di positività del test Sansure Biotech, le prestazioni dei quattro test erano quasi comparabili.Pertanto, il test Sansure Biotech [Research Only (RUO)] richiede un'ulteriore convalida per il suo utilizzo in Etiopia.Infine, dovrebbero essere prese in considerazione ulteriori ricerche per valutare i test con le affermazioni del produttore appropriate.
I test di laboratorio fanno parte del piano strategico dell'Organizzazione mondiale della sanità (OMS) per la preparazione e la risposta (SPRP) della malattia da coronavirus 2019 (COVID-19).L'OMS consiglia ai paesi di sviluppare capacità di laboratorio per migliorare la preparazione, la corretta gestione dei casi, la vigilanza e la risposta rapida alle sfide della salute pubblica.Ciò suggerisce che il ruolo del laboratorio è fondamentale per caratterizzare la malattia e l'epidemiologia degli agenti infettivi emergenti e controllarne la diffusione.
La diagnosi di COVID-19 richiede informazioni epidemiologiche e mediche, sintomi/segni personali e dati radiografici e di laboratorio2.Da quando è stata segnalata l'epidemia di COVID-19 a Wuhan, in Cina, in tutto il mondo sono stati sviluppati molti test commerciali di amplificazione dell'acido nucleico (NAAT).La reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa in tempo reale (rRT-PCR) è stata utilizzata come metodo di routine e standard per la diagnosi di laboratorio dell'infezione da sindrome respiratoria acuta grave 2 (SARS-CoV-2) 3.Il rilevamento molecolare di SARS-CoV-2 si basa tipicamente sui geni N (gene della proteina nucleocapside), E (gene della proteina dell'involucro) e RdRp (gene della RNA polimerasi RNA-dipendente) in ORF1a/b (frame di lettura aperto 1a/b) .gene) regione identificata dal genoma virale.Sono considerate le principali regioni conservate trovate nei genomi virali per il riconoscimento del virus4.Tra questi geni, i geni RdRp ed E hanno un'elevata sensibilità di rilevamento analitico, mentre il gene N ha una bassa sensibilità analitica5.
Le prestazioni dei test PCR possono variare a seconda di vari fattori quali: reagenti di estrazione, reagenti di amplificazione/rilevamento, metodo di estrazione, qualità della macchina PCR e altri strumenti.Ad aprile 2020, più di 48 diversi dispositivi diagnostici provenienti da nove paesi hanno ricevuto l'autorizzazione all'uso di emergenza (EUA) per la diagnostica COVID-196.In Etiopia, più di 14 piattaforme PCR in tempo reale vengono utilizzate per il rilevamento PCR di SARS-CoV-2 presso 26 istituzioni sanitarie pubbliche, tra cui ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 e Quant-studio7.Inoltre, sono disponibili vari kit di test PCR, come il test Daan Gene, il test Abbott SARS-CoV-2, il test Sansure Biotech e il test SARS-CoV-2 BGI.Sebbene rRT-PCR sia altamente sensibile, alcuni pazienti con COVID-19 riportano risultati falsi negativi a causa di copie insufficienti di acido ribonucleico virale (RNA) nei campioni a causa di raccolta, trasporto, conservazione e manipolazione impropri e test di laboratorio.condizioni e azioni del personale8.Inoltre, la manipolazione errata del campione o del controllo, l'impostazione della soglia del ciclo (Ct) e la reattività incrociata con altri acidi nucleici patogeni o RNA SARS-CoV-2 inattivo/residuo possono portare a risultati falsi positivi nei test rRT-PCR9.Pertanto, è chiaro che i test PCR possono effettivamente identificare i portatori di frammenti genici, poiché non possono nemmeno distinguere tra geni virali veramente attivi, quindi i test possono identificare solo i portatori e non i pazienti10.Pertanto, è importante valutare le prestazioni diagnostiche utilizzando metodi standard nel nostro contesto.Sebbene molti reagenti NAAT siano disponibili presso l'Ethiopian Public Health Institute (EPHI) e in tutto il paese, non è stata ancora riportata alcuna valutazione comparativa della loro efficacia.Pertanto, questo studio mirava a valutare le prestazioni comparative dei kit disponibili in commercio per il rilevamento di SARS-CoV-2 mediante rRT-PCR utilizzando campioni clinici.
In questo studio sono stati inclusi un totale di 164 partecipanti con sospetto COVID-19.La maggior parte dei campioni proveniva da centri di trattamento (118/164 = 72%), mentre i restanti 46 (28%) partecipanti provenivano da centri non di trattamento.Tra i partecipanti non trattati presso il centro, 15 (9,1%) avevano casi clinicamente sospetti e 31 (18,9%) avevano contatti di casi confermati.Novantatré (56,7%) partecipanti erano maschi e l'età media (± SD) dei partecipanti era di 31,10 (± 11,82) anni.
In questo studio sono stati determinati i tassi positivi e negativi di quattro test per COVID-19.Pertanto, i tassi positivi del test Abbott SARS-CoV-2, del test Daan Gene 2019-nCoV, del test SARS-CoV-2 BGI e del test Sansure Biotech 2019-nCoV sono stati rispettivamente del 59,1%, 58,5%, 57,9% e 55,5%. .I punteggi positivi e negativi dello standard di riferimento composito (CRS) erano rispettivamente 97 (59,1%) e 67 (40,9%) (Tabella 1).In questo studio, la definizione di CRS era basata sulla regola "qualsiasi positivo", per cui su quattro risultati del test, due o più risultati del test che hanno dato lo stesso risultato sono stati considerati veri positivi o negativi.
In questo studio, abbiamo trovato una concordanza percentuale negativa (NPA) del 100% (IC 95% 94,6-100) per tutte le analisi rispetto alla CRS.L'analisi Sansure Biotechnology ha mostrato un PPA minimo del 93,8% (IC 95% 87,2-97,1) e l'analisi Daan Gene 2019-nCoV ha avuto una concordanza complessiva del 99,4% (IC 95% 96,6-99,9).Al contrario, la concordanza complessiva tra il test SARS-CoV-2 BGI e il test Sansure Biotech 2019-nCoV è stata rispettivamente del 98,8% e del 96,3% (Tabella 2).
Il coefficiente di concordanza kappa di Cohen tra i risultati del test CRS e Abbott SARS-CoV-2 era completamente coerente (K = 1,00).Allo stesso modo, anche i valori kappa di Cohen rilevati da Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI e Sansure Biotech 2019-nCoV sono pienamente coerenti con CRS (K ≥ 0,925).In questa analisi comparativa, il test chi-quadrato (test McNemar) ha mostrato che i risultati del test Sansure Biotech 2019-nCoV erano significativamente diversi dai risultati CRS (p = 0,031) (Tabella 2).
Come mostrato in Fig.1 la percentuale del valore Ct più basso (<20 Ct) del test Abbott SARS-CoV-2 (gene RdRp e N combinato) era dell'87,6% e il valore Ct del gene ORF1a/b del test Sansure Biotech 2019-nCoV ha mostrato che la percentuale di basso Il valore Ct (<20 Ct) era del 50,3% e il valore Ct elevato (36-40 Ct) era del 3,2%. 1 la percentuale del valore Ct più basso (<20 Ct) del test Abbott SARS-CoV-2 (gene RdRp e N combinato) era dell'87,6% e il valore Ct del gene ORF1a/b del test Sansure Biotech 2019-nCoV ha mostrato che la percentuale di basso Il valore Ct (<20 Ct) era del 50,3% e il valore Ct elevato (36-40 Ct) era del 3,2%.Come mostrato in Fig.1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) составил 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого значения Ct (< 20 Ct) composto dal 50,3%, mentre il Ct medio (36–40 Ct) è del 3,2%. 1, la percentuale dell'analisi del valore Ct più basso (<20 Ct) di Abbott SARS-CoV-2 (gene combinato RdRp e N) era dell'87,6% e il valore Ct dell'analisi del gene ORF1a/b di Sansure Biotech 2019-nCoV ha mostrato che la percentuale di valore Ct basso (<20 Ct) rappresentava il 50,3% e il valore Ct alto (36-40 Ct) rappresentava il 3,2%.如 图 1 所 示 ， ABBOTT SARS-COV-2 检测 （结合 RDRP 和 N 基因） 的 最 低 低 ct 值 百分比 （<20 ct） 87,6%， biotecno值(< 20 Ct) 的百分比为50,3%, 高Ct 值(36–40 Ct) 的百分比为3,2%. Come mostrato nella Figura 1, la percentuale più bassa del valore Ct (<20 Ct) del test Abbott SARS-CoV-2 (combinazione del gene RdRp e N) è dell'87,6%, il valore Ct del gene ORF1a/b del test Sansure Biotech 2019-nCoV mostra una bassa percentuale di Ct 值 (< 20 Ct) 的 è del 50,3%, la percentuale di 高 Ct 值 (36–40 Ct) 的 è del 3,2%. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (сочетающий гены RdRp и N) имел самое низкое процентное значение Ct (< 20 Ct) в размере 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b в исследовании Sansure Biotech 2019 - Анализ nCoV показал низкий Ct. Come mostrato nella Figura 1, il test Abbott SARS-CoV-2 (che combina i geni RdRp e N) ha avuto il valore Ct percentuale più basso (<20 Ct) all'87,6%, mentre il valore Ct del gene ORF1a/b nel Sansure Studio Biotech 2019 – L'analisi di nCoV ha mostrato un basso Ct. Процент значений (< 20 Ct) составил 50,3%, а процент высоких значений Ct (36–40 Ct) составил 3,2%. La percentuale di valori (< 20 Ct) era del 50,3% e la percentuale di valori Ct alti (36-40 Ct) era del 3,2%.Il test Abbott SARS-CoV-2 B ha registrato valori Ct superiori a 30. D'altra parte, sul saggio BGI SARS-CoV-2 il gene ORF1a/b aveva un valore Ct elevato (> 36 Ct) la percentuale era del 4% (Fig. 1). D'altra parte, sul saggio BGI SARS-CoV-2 il gene ORF1a/b aveva un valore Ct elevato (> 36 Ct) la percentuale era del 4% (Fig. 1). In altre condizioni, nell'analisi di BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b è presente una percentuale di Ct (> 36 Ct), un fattore di crescita costante del 4% (ris. 1). D'altra parte, nell'analisi di BGI SARS-CoV-2 il gene ORF1a/b aveva un valore Ct elevato (> 36 Ct), la cui percentuale era del 4% (Fig. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比为4%（图1）。 D'altra parte, nel rilevamento BGI SARS-CoV-2, la percentuale di gene ORF1a/b con valore Ct elevato (>36 Ct) è del 4% (Figura 1). In altre condizioni, nell'analisi del BGI SARS-CoV-2 per quanto riguarda il genere ORF1a/b con livelli di Ct (>36 Ct) pari al 4% (ris. 1). Nell'analisi BGI SARS-CoV-2, invece, la percentuale di geni ORF1a/b con alti valori di Ct (>36 Ct) era del 4% (Fig. 1).
In questo studio, abbiamo prelevato 164 campioni nasofaringei.Per tutti i tipi di test, l'isolamento e l'amplificazione dell'RNA sono stati eseguiti utilizzando i metodi e i kit raccomandati dai rispettivi produttori.
Questo studio ha dimostrato che il test di Abbott per SARS-CoV-2 ha le stesse prestazioni di rilevamento del CRS, con concordanza positiva, negativa e complessiva del 100%.L'accordo kappa di Cohen è 1,00, che indica il pieno accordo con CRS.Uno studio simile dell'Università di Washington negli Stati Uniti ha rilevato che la sensibilità e la specificità complessive del test Abbott per SARS-CoV-2 erano rispettivamente del 93% e del 100%, rispetto al test determinato in laboratorio (LDA) del CDC .11. Il sistema di rilevamento Abbott SARS-CoV-2 si basa sul rilevamento combinato simultaneo dei geni N e RdRp, poiché entrambi i geni sono più sensibili, riducendo al minimo i falsi negativi12.Uno studio condotto a Vienna, in Austria, ha inoltre dimostrato che grandi volumi di campioni estratti e volumi di eluente di rilevamento riducono al minimo gli effetti di diluizione e aumentano l'efficienza di rilevamento13.Pertanto, la corrispondenza perfetta di Abbott per il test SARS-CoV-2 può essere associata a un sistema di rilevamento della piattaforma che rileva simultaneamente i geni combinatori, estrae un gran numero di campioni (0,5 ml) e utilizza una grande quantità di eluente (40 µl).
I nostri risultati hanno anche mostrato che le prestazioni di rilevamento del test genetico Daan erano quasi le stesse di quelle del CRS.Ciò è coerente con uno studio14 condotto presso l'Anhui University di Huainan, in Cina, e con l'affermazione del produttore di un accordo positivo al 100%.Nonostante le segnalazioni di risultati coerenti, un campione è risultato falso negativo dopo aver ripetuto il test dello stesso eluato, ma è risultato positivo nei test Abbott SARS-CoV-2 e Sansure Biotech nCoV-2019.Ciò suggerisce che potrebbe esserci variabilità nei risultati tra diversi tipi di analisi. Tuttavia, nello studio condotto in Cina15, il risultato del test Daan Gene era significativamente diverso (p < 0,05) rispetto al test di riferimento definito dal laboratorio. Tuttavia, nello studio condotto in Cina15, il risultato del test Daan Gene era significativamente diverso (p < 0,05) rispetto al test di riferimento definito dal laboratorio. " Tuttavia, in uno studio in Cina15, il risultato dell'analisi di Daan Gene era significativamente diverso (p < 0,05) dall'analisi di riferimento del laboratorio.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异。05p（0.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差 <0.05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Daan значительно отличались (p < 0,05) по сравнению с его эталонным лабораторным тестом. Tuttavia, in uno studio in Cina15, i risultati del test genetico di Daan erano significativamente diversi (p < 0,05) rispetto al suo test di laboratorio di riferimento.Questa discrepanza può essere dovuta alla sensibilità del test di riferimento per rilevare SARS-CoV-2 e ulteriori studi potrebbero essere importanti per determinare la causa.
Inoltre, il nostro studio ha valutato le prestazioni comparative del test SARS-CoV-2 BGI con CRS, mostrando un'eccellente concordanza percentuale positiva (PPA = 97,9%), concordanza percentuale negativa (NPA = 100%) e concordanza percentuale complessiva per genere ( OPA).).= 98,8%).I valori Kappa di Cohen hanno mostrato un buon accordo (K = 0,975).Studi nei Paesi Bassi16 e in Cina15 hanno mostrato risultati coerenti.Il test SARS-CoV-2 BGI è un test di rilevamento di un singolo gene (ORF1a/b) che utilizza 10 µl di eluato di amplificazione/rilevamento.Nonostante il buon accordo statistico con i nostri risultati di riferimento, l'analisi ha mancato due campioni positivi (1,22%) del campione totale.Ciò può avere enormi implicazioni cliniche per le dinamiche di trasmissione sia a livello di paziente che di comunità.
Un'altra analisi comparativa inclusa in questo studio è stata il test Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO);la percentuale di corrispondenza complessiva è stata del 96,3%.La forza dell'accordo è stata determinata anche dal valore Kappa di Cohen, che era 0,925, indicando il pieno accordo con il CRS.Ancora una volta, i nostri risultati sono identici agli studi condotti presso la Central South University di Changsha, in Cina, e presso il dipartimento di laboratorio clinico dell'ospedale popolare di Liuzhou, città di Liuzhou, Cina17. Anche se è stata registrata la buona concordanza statistica di cui sopra, il test chi-quadrato (test MacNemar) ha mostrato che il risultato del test Sansure Biotech ha avuto una differenza statisticamente significativa rispetto al CRS (p < 0,005). Anche se è stata registrata la buona concordanza statistica di cui sopra, il test chi-quadrato (test MacNemar) ha mostrato che il risultato del test Sansure Biotech ha avuto una differenza statisticamente significativa rispetto al CRS (p < 0,005). Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеет статистически значимое различие по сравнению с CRS (p < 0,005). Sebbene sia stato registrato il buon accordo statistico di cui sopra, il test chi-quadrato (test McNemar) ha mostrato che il risultato del test Sansure Biotech presentava una differenza statisticamente significativa rispetto al CRS (p < 0,005).尽管 记录 了 上述 良好 的 统计 一致性 ， 但 卡方 （（Macnemar 检验） 表明 ， Biotecnola Sansura 检测 的 结果 CRS 相比 具有 统计学 差异 （P <0,005）））尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致 性 ， 但 检验 （（MacNemar 检验 表明 ， ， Biotecnologio Sansure 检测 结果 CRS 相比 具有 显着 （（P <0,005 。。。。。。。。。。。。。。。。 。。。）））） Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал статистически значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech и CRS. Nonostante il buon accordo statistico notato sopra, il test del chi-quadrato (test di McNemar) ha mostrato una differenza statisticamente significativa (p < 0,005) tra il test Sansure Biotech e il CRS.Sei campioni (3,66%) sono risultati falsi negativi rispetto al CRS (tabella supplementare 1);questo è molto importante, soprattutto vista la dinamica di trasmissione del virus.I dati di cui sopra supportano anche questo basso tasso di rilevamento15.
In questo studio, i valori Ct sono stati determinati per ciascun test e rispettiva piattaforma, con il valore Ct medio più basso riportato nel test Abbott SARS-CoV-2.Questo risultato potrebbe essere correlato al sistema di test genetici combinati simultanei di Abbott per il rilevamento di SARS-CoV-2.Pertanto, secondo la Figura 1, l'87,6% dei risultati di Abbott SARS-CoV-2 aveva valori Ct inferiori a 20. Solo un piccolo numero di risultati del campione (12,4%) era compreso nell'intervallo 20-30.I valori Ct superiori a 30 non sono stati registrati.Oltre all'uso da parte di Abbott del formato di test genetico del pannello SARS-CoV-2, questo risultato potrebbe essere correlato al limite di rilevamento inferiore (32,5 copie di RNA/mL)18, che è tre volte inferiore al limite inferiore dell'azienda di 100 copie di RNA / ml.ml)19.
Questo studio ha alcune limitazioni: in primo luogo, non disponiamo di metodi standard/di riferimento [come la carica virale o altri test di laboratorio (LDA)] a causa della mancanza di risorse.In secondo luogo, tutti i campioni utilizzati in questo studio erano tamponi nasofaringei, mentre i risultati non erano applicabili ad altri tipi di campioni e, in terzo luogo, la dimensione del nostro campione era ridotta.
Questo studio ha confrontato le prestazioni di quattro test rRT-PCR per SARS-CoV-2 utilizzando campioni nasofaringei.Tutti i test di rilevamento hanno avuto prestazioni quasi comparabili, ad eccezione del test Sansure Biotech. Inoltre, il basso tasso di positività è stato identificato nel test Sansure Biotech rispetto al CRS (p <0,05). Inoltre, il basso tasso di positività è stato identificato nel test Sansure Biotech rispetto al CRS (p <0,05). Tuttavia, nel test Sansure Biotech non è stato rilevato alcun problema da parte di poliziotti con CRS (p < 0,05). Inoltre, il test Sansure Biotech ha mostrato una bassa percentuale di risultati positivi rispetto al CRS (p < 0,05).此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0.05)。此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0.05)。 Inoltre, l'analisi di Sansure Biotech è stata effettuata con una quantità minima di risultati ottenuti da poligoni in relazione a CRS (p < 0,05). Inoltre, il test Sansure Biotech ha avuto un tasso di positività inferiore rispetto al CRS (p <0,05).L'analisi Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) di PPA, NPA e concordanza complessiva ha superato il 93,5% con una forza Cohen Kappa del valore di concordanza di 0,925.Infine, il Sansure Biotech Assay (RUO) necessita di un'ulteriore convalida per l'uso in Etiopia e dovrebbero essere prese in considerazione ulteriori ricerche per valutare le affermazioni dei singoli produttori.
Il disegno dello studio comparativo è stato condotto presso quattro strutture sanitarie ad Addis Abeba, l'ospedale Eka Kotebe, il Millennium Church Treatment Centre, lo Zewooditu Memorial Hospital e il St. Peter's Tuberculosis Specialist Hospital.I dati sono stati raccolti tra il 1° e il 31 dicembre 2020. Le strutture mediche per questo studio sono state appositamente scelte in base al loro elevato numero di casi e alla disponibilità dei principali centri di cura in città.Allo stesso modo, gli strumenti, inclusi gli strumenti per PCR in tempo reale ABI 7500 e Abbott m2000, sono stati selezionati in base alle raccomandazioni dei produttori di reagenti NAAT e per questo studio sono stati selezionati quattro kit di rilevamento PCR, poiché la maggior parte dei laboratori in Etiopia utilizzava almeno almeno quattro di loro.test genetico, test Abbott SARS-CoV-2, test Sansure Biotech e test SARS-CoV-2 BGI eseguiti durante lo studio).
I test per SARS-CoV-2 sono stati eseguiti dall'1 al 30 dicembre 2020 utilizzando 3 ml di Viral Transport Medium (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, Cina) da individui indagati per COVID-19 riferiti a EPHI.I campioni nasofaringei sono stati raccolti da raccoglitori di campioni addestrati e inviati all'EPHI in confezioni triple.Prima dell'isolamento dell'acido nucleico, a ciascun campione viene assegnato un numero di identificazione univoco.L'estrazione viene eseguita da ciascun campione immediatamente dopo l'arrivo utilizzando metodi di estrazione manuali e automatici.Pertanto, per l'estrazione automatica di Abbott m2000, 1,3 ml (inclusi 0,8 ml di volume morto e 0,5 ml di volume di ingresso per l'estrazione) del campione sono stati estratti da ciascun campione e fatti passare attraverso l'Abbott DNA Sample Preparation System (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, Stati Uniti).) Un lotto di 96 [92 campioni, due controlli di rilevamento e due controlli non modello (NTC)] è stato incluso nel processo complessivo (recupero e rilevamento) di due cicli di SARS-CoV-2 (EUA) in tempo reale.estrazione.Allo stesso modo, per l'estrazione manuale, utilizzare gli stessi campioni (per l'estrazione e la scoperta automatiche).Pertanto, durante tutto il processo, 140 µl di campioni sono stati aliquotati ed estratti utilizzando il kit QIAamp Viral RNA Mini (QIAGEN GmbH, Hilden, Germania) in lotti di 24 (inclusi 20 campioni, due controlli del test e due NTC) in nove cicli.Gli eluati estratti manualmente sono stati amplificati e rilevati utilizzando un termociclatore ABI 7500 utilizzando il test SARS-CoV-2 BGI, il test Daan Gene e il test Sansure Biotech.
L'isolamento e la purificazione automatizzati dell'RNA virale SARS-CoV-2 seguono il principio delle sfere magnetiche utilizzando i reagenti per la preparazione dei campioni di DNA di Abbott.L'inattivazione dei campioni e la solubilizzazione delle particelle virali viene effettuata utilizzando un detergente contenente isotiocianato di guanidina per denaturare la proteina e inattivare l'RNasi.L'RNA viene quindi separato dalla proteina mediante separazione in fase solida utilizzando la silice, cioè il sale di guanidinio e il pH alcalino del tampone di lisi favoriscono il legame degli acidi nucleici alla silice (SiO2).La fase di risciacquo rimuove le proteine ​​e i detriti rimanenti per produrre una soluzione limpida.L'RNA trasparente viene isolato dalle microparticelle a base di silice utilizzando il campo magnetico dello strumento20,21.D'altra parte, l'isolamento manuale e la purificazione dell'RNA vengono eseguiti con il metodo della colonna rotante utilizzando la centrifugazione invece di un supporto magnetico e la separazione delle microparticelle dall'eluente.
Il test di rilevamento Abbott Real-Time SARS-CoV-2 (Abbott Molecular, Inc.) è stato eseguito secondo le istruzioni del produttore, che ha ricevuto EUA19,22 dall'OMS e dalla FDA.In questo protocollo, l'inattivazione del campione prima dell'estrazione è stata eseguita in un bagno d'acqua a 56 ° C per 30 min.Dopo l'inattivazione del virus, l'estrazione dell'acido nucleico è stata eseguita su uno strumento Abbott m2000 SP da 0,5 ml di VTM utilizzando un sistema di preparazione del campione di DNA Abbott m2000.secondo il produttore.L'amplificazione e il rilevamento sono stati eseguiti utilizzando uno strumento Abbott m2000 RT-PCR e il doppio rilevamento è stato eseguito per i geni RdRp e N.ROX) e VIC P (colorante proprietario) per il targeting e il rilevamento dei controlli interni, consentendo il rilevamento simultaneo di entrambi i prodotti di amplificazione 19 .
Il metodo di rilevamento dell'amplificazione di questo kit si basa sulla tecnologia RT-PCR one-step.I geni ORF1a/b e N sono stati selezionati come regioni conservate dalla Daan Gene Technology per rilevare l'amplificazione della regione target.Primer specifici e sonde fluorescenti (sonde del gene N etichettate con FAM, sonde ORF1a/b etichettate con VIC) sono stati progettati per rilevare l'RNA SARS-CoV-2 nei campioni.L'eluente e le master mix finali sono stati preparati aggiungendo 5 µl di eluente a 20 µl della master mix fino ad un volume finale di 25 µl.L'amplificazione e il rilevamento sono stati eseguiti simultaneamente su uno strumento PCR in tempo reale ABI 750024.
I geni ORF1a/b e N sono stati rilevati utilizzando il kit diagnostico Sansure Biotech nCoV-2019 Nucleic Acid (rilevamento PCR fluorescente).Preparare sonde specifiche per ogni gene bersaglio selezionando il canale FAM per la regione ORF1a/be il canale ROX per il gene N.A questo kit di analisi, i reagenti di eluente e master mix vengono aggiunti come segue: preparare 30 µl di reagente di master mix e 20 µl di campione eluito per il rilevamento/l'amplificazione.La PCR in tempo reale ABI 750025 è stata utilizzata per l'amplificazione/rilevamento.
Il test SARS-CoV-2 BGI è un kit rRT-PCR fluorescente in tempo reale per la diagnosi di COVID-19.La regione target si trova nella regione ORF1a/b del genoma SARS-CoV-2, che è un metodo di rilevamento di un singolo gene.Inoltre, il gene domestico umano β-actina è un gene bersaglio regolato internamente.La master mix viene preparata mescolando 20 µl del reagente della master mix e 10 µl del campione di RNA estratto in una piastra a pozzetti26.Per l'amplificazione e il rilevamento è stato utilizzato uno strumento PCR quantitativo in tempo reale fluorescente ABI 7500.Tutte le amplificazioni degli acidi nucleici, le condizioni della corsa PCR per ciascun test e l'interpretazione dei risultati sono state eseguite secondo le istruzioni del rispettivo produttore (Tabella 3).
In questa analisi comparativa, non abbiamo utilizzato il metodo standard di riferimento per determinare la concordanza percentuale (positiva, negativa e complessiva) e altri parametri di confronto per le quattro analisi.Ogni confronto di test è stato effettuato con CRS, in questo studio il CRS è stato stabilito dalla regola "qualsiasi positivo" e il risultato è stato determinato, non da un singolo test, abbiamo utilizzato almeno due risultati di test abbinati.Inoltre, nel caso della trasmissione di COVID-19, i risultati falsi negativi sono più pericolosi dei risultati falsi positivi.Pertanto, per dire "positivo" nel modo più accurato possibile da un risultato CRS, almeno due test del test devono essere positivi, il che significa che è probabile che almeno un risultato positivo provenga da un test EUA.Pertanto, su quattro risultati del test, due o più risultati del test che danno lo stesso risultato sono considerati veri positivi o negativi18,27.
I dati sono stati raccolti utilizzando moduli di estrazione dei dati strutturati, l'inserimento dei dati e l'analisi sono stati eseguiti utilizzando il software statistico Excel e SPSS versione 23.0 per le statistiche descrittive.Sono stati analizzati la concordanza percentuale positiva, negativa e complessiva ed è stato utilizzato un punteggio Kappa per determinare il grado di concordanza di ciascun metodo con la CRS.I valori kappa sono interpretati come segue: da 0,01 a 0,20 per concordanza lieve, da 0,21 a 0,40 per concordanza generale, da 0,41 a 0,60 per concordanza moderata, da 0,61 a 0,80 per concordanza maggiore e da 0,81 a 0,99 per concordanza completa28.
L'autorizzazione etica è stata ottenuta dall'Università di Addis Abeba e tutti i protocolli sperimentali per questo studio sono stati approvati dal comitato di revisione dell'etica scientifica dell'Istituto di sanità pubblica etiope.Il numero di riferimento per la licenza etica EPHI è EPHI/IRB-279-2020.Tutti i metodi sono stati applicati in conformità con le raccomandazioni e le disposizioni delle linee guida nazionali etiopiche complete per il trattamento di COVID-19.Inoltre, è stato ottenuto il consenso informato scritto da tutti i partecipanti allo studio prima della partecipazione allo studio.
Tutti i dati ottenuti o analizzati in questo studio sono inclusi in questo articolo pubblicato.I dati a supporto dei risultati di questo studio sono disponibili presso il rispettivo autore su ragionevole richiesta.
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