Fattori di interferenza nelle reazioni di PCR

Durante la reazione PCR, si incontrano spesso alcuni fattori interferenti.
A causa dell'elevata sensibilità della PCR, la contaminazione è considerata uno dei fattori più importanti che influenzano i risultati della PCR e può produrre risultati falsi positivi.
Altrettanto critiche sono le varie fonti che portano a risultati falsi negativi.Se una o più parti essenziali della miscela PCR o la stessa reazione di amplificazione sono inibite o interferite, il test diagnostico può essere ostacolato.Ciò può portare a una riduzione dell'efficienza e persino a risultati falsi negativi.
Oltre all'inibizione, può verificarsi la perdita dell'integrità dell'acido nucleico target a causa delle condizioni di spedizione e/o conservazione prima della preparazione del campione.In particolare, temperature elevate o una conservazione inadeguata possono causare danni alle cellule e agli acidi nucleici.La fissazione di cellule e tessuti e l'inclusione in paraffina sono cause ben note di frammentazione del DNA e un problema persistente (vedere le figure 1 e 2).In questi casi, anche l'isolamento e la purificazione ottimali non aiutano.

Figura 1 |Effetto dell'immobilizzazione sull'integrità del DNA
L'elettroforesi su gel di agarosio ha mostrato che la qualità del DNA isolato dalle sezioni di paraffina delle autopsie variava considerevolmente.DNA di diverse lunghezze medie dei frammenti era presente negli estratti a seconda del metodo di fissazione.Il DNA è stato conservato solo quando fissato in campioni congelati nativi e in formalina neutra tamponata.L'uso di un fissativo Bouin fortemente acido o di formalina contenente acido formico non tamponato ha provocato una significativa perdita di DNA.La frazione rimanente è altamente frammentata.
A sinistra, la lunghezza dei frammenti è espressa in coppie di kilobase (kbp)

Figura 2 |Perdita di integrità dei bersagli dell'acido nucleico
(a) Uno spazio di 3′-5′ su entrambi i filamenti provocherà una rottura nel DNA bersaglio.la sintesi del DNA avverrà ancora sul piccolo frammento.Tuttavia, se sul frammento di DNA manca un sito di ricottura del primer, si verifica solo l'amplificazione lineare.Nel caso più favorevole, i frammenti possono risaturarsi a vicenda, ma le rese saranno piccole e inferiori ai livelli di rilevamento.
(b) La perdita di basi, dovuta principalmente alla depurinazione e alla formazione del dimero di timidina, porta a una diminuzione del numero di legami H e a una diminuzione di Tm.Durante la fase di riscaldamento allungata, i primer si scioglieranno dal DNA della matrice e non si ricottura nemmeno in condizioni meno rigorose.
(c) Le basi di timina adiacenti formano un dimero TT.
Un altro problema comune che si verifica spesso nella diagnostica molecolare è il rilascio non ottimale di acidi nucleici target rispetto all'estrazione con fenolo-cloroformio.In casi estremi, questo può essere associato a falsi negativi.È possibile risparmiare molto tempo bollendo la lisi o la digestione enzimatica dei detriti cellulari, ma questo metodo spesso si traduce in una bassa sensibilità della PCR a causa dell'insufficiente rilascio di acido nucleico.

Inibizione dell'attività della polimerasi durante l'amplificazione

In generale, l'inibizione viene utilizzata come concetto contenitore per descrivere tutti i fattori che portano a risultati PCR non ottimali.In senso strettamente biochimico, l'inibizione è limitata all'attività dell'enzima, cioè riduce o previene la conversione substrato-prodotto attraverso l'interazione con il sito attivo della DNA polimerasi o del suo cofattore (es. Mg2+ per la Taq DNA polimerasi).
I componenti del campione o vari tamponi ed estratti contenenti reagenti possono inibire direttamente l'enzima o intrappolare i suoi cofattori (ad es. EDTA), inattivando così la polimerasi e, a sua volta, portando a risultati PCR ridotti o falsi negativi.
Tuttavia, molte interazioni tra i componenti della reazione e gli acidi nucleici contenenti il ​​bersaglio sono anche designate come "inibitori della PCR".Una volta che l'integrità della cellula viene interrotta dall'isolamento e l'acido nucleico viene rilasciato, possono verificarsi interazioni tra il campione e la sua soluzione circostante e la fase solida.Ad esempio, gli "scavenger" possono legare il DNA a filamento singolo o doppio attraverso interazioni non covalenti e interferire con l'isolamento e la purificazione riducendo il numero di bersagli che alla fine raggiungono il recipiente di reazione della PCR.
In generale, gli inibitori della PCR sono presenti nella maggior parte dei fluidi corporei e dei reagenti utilizzati per test diagnostici clinici (urea nelle urine, emoglobina ed eparina nel sangue), integratori alimentari (componenti organici, glicogeno, grassi, ioni Ca2+) e componenti nell'ambiente (fenoli , metalli pesanti)

Gli inibitori della PCR più diffusi si possono trovare nei batteri e nelle cellule eucariotiche, nel DNA non bersaglio, nelle macromolecole che legano il DNA delle matrici tissutali e nelle apparecchiature di laboratorio come guanti e plastica.La purificazione degli acidi nucleici durante o dopo l'estrazione è il metodo preferito per rimuovere gli inibitori della PCR.
Oggi, varie apparecchiature di estrazione automatizzate possono sostituire molti protocolli manuali, ma il recupero e/o la purificazione degli obiettivi al 100% non è mai stato raggiunto.Potenziali inibitori possono essere ancora presenti negli acidi nucleici purificati o possono aver già avuto effetto.Esistono diverse strategie per ridurre l'impatto degli inibitori.La scelta della polimerasi appropriata può avere un impatto significativo sull'attività dell'inibitore.Altri metodi collaudati per ridurre l'inibizione della PCR sono l'aumento della concentrazione della polimerasi o l'applicazione di additivi come la BSA.
L'inibizione delle reazioni di PCR può essere dimostrata mediante l'uso del controllo di qualità del processo interno (IPC).
È necessario prestare attenzione a rimuovere tutti i reagenti e le altre soluzioni nel kit di estrazione, come etanolo, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanolo e fenolo, dall'isolato di acido nucleico mediante un'accurata fase di lavaggio.A seconda della loro concentrazione, possono attivare o inibire la PCR.