Fattori di interferenza nelle reazioni PCR

Durante la reazione PCR, si incontrano spesso alcuni fattori di interferenza.
A causa della massima sensibilità della PCR, la contaminazione è considerata uno dei fattori più importanti che influenzano i risultati della PCR e può produrre risultati falsi positivi.
Altrettanto critici sono le varie fonti che portano a risultati falsi negativi. Se una o più parti essenziali della miscela di PCR o la stessa reazione di amplificazione sono inibite o interferite, il test diagnostico può essere ostacolato. Ciò può portare a una ridotta efficienza e persino a risultati falsi negativi.
Oltre all'inibizione, può verificarsi la perdita di integrità dell'acido nucleico bersaglio a causa delle condizioni di spedizione e/o di stoccaggio prima della preparazione del campione. In particolare, alte temperature o conservazione inadeguata possono causare danni da cellule e acidi nucleici. La fissazione delle cellule e i tessuti e l'incorporamento della paraffina sono cause ben note di frammentazione del DNA e un problema persistente (vedere le figure 1 e 2). In questi casi, anche l'isolamento e la purificazione ottimali non aiuteranno.

Figura 1 | Effetto dell'immobilizzazione sull'integrità del DNA
L'elettroforesi su gel di agarosio ha mostrato che la qualità del DNA isolata dalle sezioni di paraffina delle autopsie variava considerevolmente. Nell'estratti era presente un DNA di diverse lunghezze medie dei frammenti medi a seconda del metodo di fissazione. Il DNA è stato preservato solo se fisso in campioni surgelati nativi e in formalina neutra tamponata. L'uso di un fissativo di bouin fortemente acido o di formalina contenente acido e non contenente acido ha comportato una perdita significativa del DNA. La frazione rimanente è altamente frammentata.
A sinistra, la lunghezza dei frammenti è espressa in coppie di kilobase (KBP)

Figura 2 | Perdita di integrità degli obiettivi di acido nucleico
(a) Un divario 3′-5 ′ su entrambi i fili comporterà una pausa nel DNA bersaglio. La sintesi del DNA si verificherà ancora sul piccolo frammento. Tuttavia, se manca un sito di ricottura del primer sul frammento del DNA, si verifica solo un'amplificazione lineare. Nel caso più favorevole, i frammenti possono essere rosaturali a vicenda, ma i rendimenti saranno piccoli e al di sotto dei livelli di rilevamento.
(b) La perdita di basi, principalmente dovuta alla formazione di depurinazione e dimero di timidina, porta a una diminuzione del numero di legami H e una diminuzione della TM. Durante la fase di riscaldamento allungata, i primer si scioglieranno dal DNA della matrice e non ricorreranno nemmeno in condizioni meno rigorose.
(c) basi di timina adiacenti formano un dimero TT.
Un altro problema comune che si verifica spesso nella diagnostica molecolare è il rilascio non ottimale di acidi nucleici bersaglio rispetto all'estrazione di fenolo-cloroformio. In casi estremi, questo può essere associato a falsi negativi. Molto tempo può essere risparmiato mediante lisi bollente o digestione enzimatica dei detriti cellulari, ma questo metodo spesso provoca una bassa sensibilità alla PCR a causa dell'insufficiente rilascio di acido nucleico.

Inibizione dell'attività della polimerasi durante l'amplificazione

In generale, l'inibizione viene utilizzata come concetto di contenitore per descrivere tutti i fattori che portano a risultati della PCR non ottimale. In senso strettamente biochimico, l'inibizione è limitata all'attività dell'enzima, cioè, riduce o impedisce la conversione del produttore del substrato attraverso l'interazione con il sito attivo della DNA polimerasi o il suo cofattore (EG, MG2+ per Taq DNA polimerasi).
I componenti nel campione o vari tamponi ed estratti contenenti reagenti possono inibire direttamente l'enzima o intrappolare i suoi cofattori (EG EDTA), inattivando così la polimerasi e, a sua volta portando a risultati di PCR ridotti o falsi negativi.
Tuttavia, molte interazioni tra componenti di reazione e acidi nucleici contenenti target sono anche designate come "inibitori della PCR". Una volta che l'integrità della cellula viene interrotta dall'isolamento e viene rilasciato l'acido nucleico, possono verificarsi interazioni tra il campione e la soluzione circostante e la fase solida. Ad esempio, i "spavengers" possono legare il DNA a singolo o doppio filamento attraverso interazioni non covalenti e interferire con l'isolamento e la purificazione riducendo il numero di bersagli che alla fine raggiungono il vaso di reazione PCR.
In generale, gli inibitori della PCR sono presenti nella maggior parte dei fluidi corporei e dei reagenti utilizzati per i test diagnostici clinici (urea nelle urine, emoglobina ed eparina nel sangue), integratori dietetici (componenti organici, glicogeno, grasso, ioni Ca2+) e componenti nell'ambiente (fenoli, metalli pesanti)

Inibitori della PCR più prevalenti possono essere trovati nei batteri e nelle cellule eucariotiche, nel DNA non bersaglio, nelle macromolecole leganti il ​​DNA delle matrici di tessuto e attrezzature di laboratorio come guanti e materie plastiche. La purificazione degli acidi nucleici durante o dopo l'estrazione è il metodo preferito per rimuovere gli inibitori della PCR.
Oggi, varie apparecchiature di estrazione automatizzata possono sostituire molti protocolli manuali, ma il recupero del 100% e/o la purificazione degli obiettivi non sono mai stati raggiunti. I potenziali inibitori possono essere ancora presenti negli acidi nucleici purificati o potrebbero aver già avuto effetto. Esistono diverse strategie per ridurre l'impatto degli inibitori. La scelta della polimerasi appropriata può avere un impatto significativo sull'attività degli inibitori. Altri metodi comprovati per ridurre l'inibizione della PCR sono l'aumento della concentrazione di polimerasi o l'applicazione di additivi come la BSA.
L'inibizione delle reazioni PCR può essere dimostrata mediante l'uso del controllo di qualità del processo interno (IPC).
Bisogna fare attenzione a rimuovere tutti i reagenti e altre soluzioni nel kit di estrazione, come etanolo, EDTA, cetab, LICL, GUSCN, SDS, isopropanolo e fenolo, dall'isolato di acido nucleico da una fase di lavaggio approfondita. A seconda della loro concentrazione, possono attivare o inibire la PCR.