Fattori di interferenza nelle reazioni di PCR

Durante la reazione PCR si incontrano spesso alcuni fattori interferenti.
A causa dell'elevata sensibilità della PCR, la contaminazione è considerata uno dei fattori più importanti che influenzano i risultati della PCR e può produrre risultati falsi positivi.
Altrettanto critiche sono le varie fonti che portano a risultati falsi negativi. Se una o più parti essenziali della miscela PCR o la reazione di amplificazione stessa vengono inibite o interferite, il test diagnostico può essere ostacolato. Ciò può portare a una riduzione dell’efficienza e persino a risultati falsi negativi.
Oltre all'inibizione, può verificarsi la perdita dell'integrità dell'acido nucleico target a causa delle condizioni di spedizione e/o conservazione prima della preparazione del campione. In particolare, temperature elevate o una conservazione inadeguata possono causare danni alle cellule e agli acidi nucleici. La fissazione di cellule e tessuti e l'inclusione in paraffina sono cause ben note di frammentazione del DNA e un problema persistente (vedere Figure 1 e 2). In questi casi, anche l’isolamento e la purificazione ottimali non aiutano.

Figura 1 | Effetto dell'immobilizzazione sull'integrità del DNA
L'elettroforesi su gel di agarosio ha mostrato che la qualità del DNA isolato dalle sezioni in paraffina delle autopsie variava considerevolmente. Negli estratti era presente DNA di diversa lunghezza media dei frammenti a seconda del metodo di fissazione. Il DNA è stato preservato solo quando fissato in campioni nativi congelati e in formalina neutra tamponata. L'uso di un fissativo Bouin fortemente acido o di formalina contenente acido formico non tamponata ha provocato una significativa perdita di DNA. La restante frazione è altamente frammentata.
A sinistra, la lunghezza dei frammenti è espressa in coppie di kilobasi (kbp)

Figura 2 | Perdita di integrità dei bersagli degli acidi nucleici
(a) Uno spazio di 3′-5′ su entrambi i filamenti risulterà in una rottura nel DNA bersaglio. la sintesi del DNA avverrà ancora sul piccolo frammento. Tuttavia, se sul frammento di DNA manca un sito di ricottura del primer, si verifica solo l'amplificazione lineare. Nel caso più favorevole, i frammenti potrebbero risaturarsi a vicenda, ma le rese saranno piccole e inferiori ai livelli di rilevamento.
(b) La perdita di basi, dovuta principalmente alla depurinazione e alla formazione di dimeri di timidina, porta ad una diminuzione del numero di legami H e ad una diminuzione di Tm. Durante la fase di riscaldamento prolungata, i primer si scioglieranno dal DNA della matrice e non si ricotteranno nemmeno in condizioni meno rigorose.
(c) Le basi di timina adiacenti formano un dimero TT.
Un altro problema comune che spesso si verifica nella diagnostica molecolare è il rilascio non ottimale degli acidi nucleici target rispetto all'estrazione con fenolo-cloroformio. In casi estremi, ciò può essere associato a falsi negativi. È possibile risparmiare molto tempo mediante la lisi bollente o la digestione enzimatica dei detriti cellulari, ma questo metodo spesso determina una bassa sensibilità della PCR a causa del rilascio insufficiente di acido nucleico.

Inibizione dell'attività della polimerasi durante l'amplificazione

In generale, l'inibizione viene utilizzata come concetto di contenitore per descrivere tutti i fattori che portano a risultati della PCR non ottimali. In senso strettamente biochimico, l'inibizione è limitata all'attività dell'enzima, cioè riduce o impedisce la conversione substrato-prodotto attraverso l'interazione con il sito attivo della DNA polimerasi o del suo cofattore (ad esempio, Mg2+ per la Taq DNA polimerasi).
I componenti del campione o vari tamponi ed estratti contenenti reagenti possono inibire direttamente l'enzima o intrappolare i suoi cofattori (ad esempio EDTA), inattivando così la polimerasi e portando a risultati PCR diminuiti o falsi negativi.
Tuttavia, molte interazioni tra i componenti della reazione e gli acidi nucleici contenenti il ​​bersaglio sono anche designate come "inibitori della PCR". Una volta che l'integrità della cellula viene interrotta dall'isolamento e l'acido nucleico viene rilasciato, possono verificarsi interazioni tra il campione e la soluzione circostante e la fase solida. Ad esempio, gli "spazzini" possono legare il DNA a filamento singolo o doppio attraverso interazioni non covalenti e interferire con l'isolamento e la purificazione riducendo il numero di bersagli che alla fine raggiungono il recipiente di reazione della PCR.
In generale, gli inibitori della PCR sono presenti nella maggior parte dei liquidi corporei e dei reagenti utilizzati per test clinici diagnostici (urea nelle urine, emoglobina ed eparina nel sangue), negli integratori alimentari (componenti organici, glicogeno, grassi, ioni Ca2+) e nei componenti ambientali (fenoli , metalli pesanti)

Gli inibitori della PCR più diffusi si possono trovare nei batteri e nelle cellule eucariotiche, nel DNA non bersaglio, nelle macromolecole che legano il DNA di matrici tissutali e in apparecchiature di laboratorio come guanti e plastica. La purificazione degli acidi nucleici durante o dopo l'estrazione è il metodo preferito per rimuovere gli inibitori della PCR.
Oggi, varie apparecchiature di estrazione automatizzata possono sostituire molti protocolli manuali, ma non è mai stato raggiunto il recupero e/o la purificazione dei target al 100%. Potenziali inibitori possono essere ancora presenti negli acidi nucleici purificati o potrebbero aver già fatto effetto. Esistono diverse strategie per ridurre l’impatto degli inibitori. La scelta della polimerasi appropriata può avere un impatto significativo sull'attività dell'inibitore. Altri metodi comprovati per ridurre l'inibizione della PCR sono l'aumento della concentrazione della polimerasi o l'applicazione di additivi come la BSA.
L'inibizione delle reazioni PCR può essere dimostrata mediante l'uso del controllo di qualità del processo interno (IPC).
È necessario prestare attenzione a rimuovere tutti i reagenti e le altre soluzioni nel kit di estrazione, come etanolo, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanolo e fenolo, dall'isolato dell'acido nucleico mediante una fase di lavaggio accurato. A seconda della loro concentrazione, possono attivare o inibire la PCR.