Test di metilazione del DNA combinato con smartphone per lo screening precoce di tumori e screening della leucemia con una precisione del 90,0%!

La diagnosi precoce del cancro basata sulla biopsia liquida è una nuova direzione di rilevamento e diagnosi del cancro proposta negli ultimi anni dal National Cancer Institute degli Stati Uniti, con l'obiettivo di rilevare precocemente il cancro o anche le lesioni precancerose. È stato ampiamente utilizzato come nuovo biomarcatore per la diagnosi precoce di varie neoplasie, tra cui cancro ai polmoni, tumori gastrointestinali, gliomi e tumori ginecologici.

L’emergere di piattaforme per identificare i biomarcatori del paesaggio della metilazione (Methylscape) ha il potenziale per migliorare significativamente lo screening precoce esistente per il cancro, mettendo i pazienti nella fase più precoce di curabilità.

Recentemente, i ricercatori hanno sviluppato una piattaforma di rilevamento semplice e diretta per il rilevamento del paesaggio di metilazione basata su nanoparticelle d'oro decorate con cisteamina (Cyst/AuNP) combinate con un biosensore basato su smartphone che consente uno screening rapido e precoce di un'ampia gamma di tumori. Lo screening precoce per la leucemia può essere eseguito entro 15 minuti dall'estrazione del DNA da un campione di sangue, con una precisione del 90,0%. Il titolo dell'articolo è Rilevamento rapido del DNA tumorale nel sangue umano utilizzando AuNP ricoperti di cisteamina e uno smartphone abilitato all'apprendimento automatico.

Figura 1. Una piattaforma di rilevamento semplice e veloce per lo screening del cancro tramite componenti Cyst/AuNP può essere realizzata in due semplici passaggi.

Ciò è mostrato nella Figura 1. Innanzitutto, è stata utilizzata una soluzione acquosa per dissolvere i frammenti di DNA. Le cisti/AuNP sono state quindi aggiunte alla soluzione mista. Il DNA normale e quello maligno hanno proprietà di metilazione diverse, risultando in frammenti di DNA con diversi modelli di autoassemblaggio. Il DNA normale si aggrega liberamente e alla fine aggrega Cisti/AuNP, il che si traduce nella natura spostata verso il rosso di Cisti/AuNP, in modo che un cambiamento di colore dal rosso al viola possa essere osservato ad occhio nudo. Al contrario, il profilo unico di metilazione del DNA tumorale porta alla produzione di cluster più grandi di frammenti di DNA.

Le immagini delle piastre da 96 pozzetti sono state scattate utilizzando la fotocamera di uno smartphone. Il DNA del cancro è stato misurato da uno smartphone dotato di apprendimento automatico rispetto ai metodi basati sulla spettroscopia.

Screening del cancro in campioni di sangue reale

Per estendere l’utilità della piattaforma di rilevamento, i ricercatori hanno applicato un sensore in grado di distinguere con successo tra DNA normale e canceroso in campioni di sangue reale. i modelli di metilazione nei siti CpG regolano epigeneticamente l'espressione genica. In quasi tutti i tipi di cancro, è stato osservato che i cambiamenti nella metilazione del DNA e quindi nell’espressione dei geni che promuovono la tumorigenesi si alternano.

Come modello per altri tumori associati alla metilazione del DNA, i ricercatori hanno utilizzato campioni di sangue di pazienti affetti da leucemia e controlli sani per studiare l’efficacia del panorama della metilazione nel differenziare i tumori leucemici. Questo biomarcatore del panorama della metilazione non solo supera i metodi esistenti di screening rapido della leucemia, ma dimostra anche la fattibilità dell’estensione alla diagnosi precoce di un’ampia gamma di tumori utilizzando questo test semplice e diretto.

È stato analizzato il DNA di campioni di sangue di 31 pazienti affetti da leucemia e 12 individui sani. come mostrato nel box plot della Figura 2a, l'assorbanza relativa dei campioni tumorali (ΔA650/525) era inferiore a quella del DNA dei campioni normali. ciò era dovuto principalmente alla maggiore idrofobicità che portava a una densa aggregazione del DNA del cancro, che impediva l'aggregazione di Cisti/AuNP. Di conseguenza, queste nanoparticelle erano completamente disperse negli strati esterni degli aggregati tumorali, il che ha comportato una diversa dispersione di Cisti/AuNP adsorbiti sugli aggregati di DNA normale e tumorale. Le curve ROC sono state quindi generate variando la soglia da un valore minimo di ΔA650/525 a un valore massimo.

Figura 2. (a) Valori di assorbanza relativi delle soluzioni di cisti/AuNP che mostrano la presenza di DNA normale (blu) e tumorale (rosso) in condizioni ottimizzate

(DA650/525) di box plot; (b) Analisi ROC e valutazione dei test diagnostici. (c) Matrice di confusione per la diagnosi di pazienti normali e oncologici. (d) Sensibilità, specificità, valore predittivo positivo (PPV), valore predittivo negativo (NPV) e accuratezza del metodo sviluppato.

Come mostrato nella Figura 2b, l'area sotto la curva ROC (AUC = 0,9274) ottenuta per il sensore sviluppato ha mostrato elevata sensibilità e specificità. Come si può vedere dal box plot, il punto più basso che rappresenta il gruppo di DNA normale non è ben separato dal punto più alto che rappresenta il gruppo di DNA canceroso; pertanto, è stata utilizzata la regressione logistica per differenziare tra i gruppi normali e quelli affetti da cancro. Dato un insieme di variabili indipendenti, stima la probabilità che si verifichi un evento, come un cancro o un gruppo normale. La variabile dipendente è compresa tra 0 e 1. Il risultato è quindi una probabilità. Abbiamo determinato la probabilità di identificazione del cancro (P) in base a ΔA650/525 come segue.

dove b=5.3533,w1=-6.965. Per la classificazione del campione, una probabilità inferiore a 0,5 indica un campione normale, mentre una probabilità pari o superiore a 0,5 indica un campione tumorale. La Figura 2c illustra la matrice di confusione generata dalla convalida incrociata "leas-it-alone", utilizzata per convalidare la stabilità del metodo di classificazione. La Figura 2d riassume la valutazione del test diagnostico del metodo, inclusi sensibilità, specificità, valore predittivo positivo (PPV) e valore predittivo negativo (NPV).

Biosensori basati su smartphone

Per semplificare ulteriormente l’analisi dei campioni senza l’uso di spettrofotometri, i ricercatori hanno utilizzato l’intelligenza artificiale (AI) per interpretare il colore della soluzione e distinguere tra individui normali e cancerosi. Detto questo, la visione artificiale è stata utilizzata per tradurre il colore della soluzione Cisti/AuNP in DNA normale (viola) o DNA canceroso (rosso) utilizzando immagini di piastre a 96 pozzetti scattate attraverso la fotocamera di un telefono cellulare. L'intelligenza artificiale può ridurre i costi e migliorare l'accessibilità nell'interpretazione del colore delle soluzioni di nanoparticelle e senza l'uso di accessori hardware ottici per smartphone. Infine, per costruire i modelli sono stati addestrati due modelli di apprendimento automatico, tra cui Random Forest (RF) e Support Vector Machine (SVM). sia il modello RF che quello SVM hanno classificato correttamente i campioni come positivi e negativi con una precisione del 90,0%. Ciò suggerisce che l’uso dell’intelligenza artificiale nel biosensing basato sui telefoni cellulari è del tutto possibile.

Figura 3. (a) Classe target della soluzione registrata durante la preparazione del campione per la fase di acquisizione dell'immagine. (b) Immagine di esempio scattata durante la fase di acquisizione dell'immagine. (c) Intensità del colore della soluzione di cisti/AuNP in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti estratta dall'immagine (b).

Utilizzando Cyst/AuNP, i ricercatori hanno sviluppato con successo una semplice piattaforma di rilevamento per il rilevamento del paesaggio di metilazione e un sensore in grado di distinguere il DNA normale dal DNA tumorale quando si utilizzano campioni di sangue reale per lo screening della leucemia. Il sensore sviluppato ha dimostrato che il DNA estratto da campioni di sangue reale era in grado di rilevare in modo rapido ed economico piccole quantità di DNA tumorale (3nM) in pazienti affetti da leucemia in 15 minuti e ha mostrato una precisione del 95,3%. Per semplificare ulteriormente l'analisi dei campioni eliminando la necessità di uno spettrofotometro, è stato utilizzato l'apprendimento automatico per interpretare il colore della soluzione e distinguere tra individui normali e cancerosi utilizzando una fotografia del telefono cellulare, ed è stata anche raggiunta una precisione del 90,0%.

Riferimento: DOI: 10.1039/d2ra05725e